Determination of Hormones in Serum by LC/MS/MS Using Agilent Bond Elut Plexa SPE

Význam tématu

Analýza nízkých koncentrací steroidních hormonů v séru je zásadní pro správné hodnocení endokrinního stavu pacienta, monitorování farmakoterapie a výzkum patofyziologie. Kombinace účinného předčištění vzorku a citlivé detekce pomocí LC/MS/MS umožňuje dosáhnout vysoké přesnosti, reproducibility a minimalizovat matriční interferenci, což je klíčové pro klinickou a farmaceutickou aplikaci.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo vyvinout robustní metodu pro souběžné stanovení 13 steroidních a pohlavních hormonů v lidském séru. Metoda kombinuje pevnou fázi extrakci (SPE) na polymerních kartáčcích Agilent Bond Elut Plexa a rychlou chromatografii s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC/MS/MS) s obousměrným ESI ionizačním režimem.

Použitá metodika a instrumentace

Pro předčištění 100 µl séra bylo použito SPE s kartáčky Bond Elut Plexa (30 mg, 1 ml). Po přidání standardních a vnitřních standardů se vzorek nasytil 0,5 % kyselinou formiovou, prošel pračkou 30 % methanol–voda a eluován čistým methanolem. Eluát se vysušil a rekonstituoval v 50/50 MeOH–voda.

Použitá instrumentace

• LC: Agilent 1290 Infinity (binar pumpa, autosampler, termostat stolu, kolonový komorový termostat)
• Kolona: Agilent InfinityLab Poroshell HPH-C8, 2.1×50 mm, 2.7 µm
• MS/MS: Agilent 6460A triple quadrupole s Jet Stream ESI
• Software: Agilent MassHunter pro akvizici a kvantifikaci

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace SPE vedla k výtěžkům 80–105 % a RSD 2,8–5,8 % pro všech 13 analyzovaných hormonů. Chromatografické podmínky s 1 mM NH4F v mobilní fázi výrazně zvýšily signál jak v pozitivním, tak negativním ESI režimu. InfinityLab Poroshell HPH-C8 kolona zajistila baseline separaci isobarických párů (aldosteron–kortizon, 11-deoxykortikosteron–17αOH progesteron, 11-deoxykortizol–kortikosteron) v rámci 10 min běhu.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlou a spolehlivou analýzu širokého spektra hormonů z malého objemu séra. Díky jednoduché přípravě vzorku a vysoké citlivosti je vhodná pro rutinní klinické laboratoře, farmakokinetické studie i toxikologii.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj směřuje k automatizaci SPE protokolu, multiplexnímu stanovení v mechanických ventilátorech a rozšíření panelu o konjugované metabolity. Integrace s vysoce výkonnými hmotovými spektrometry a využití AI pro chromatografickou optimalizaci dále zvýší citlivost a propustnost metod.

Závěr

Vyvinutá LC/MS/MS metoda s Bond Elut Plexa SPE a Agilent Poroshell HPH-C8 kolónou poskytuje rychlé, citlivé a reprodukovatelné stanovení 13 hormonů v séru. Vysoké recoveries, nízké RSD a krátký analýzní čas ji předurčují pro široké praktické nasazení v biomedicínském výzkumu i klinické praxi.

Reference

1. Fu R.; Zhai A. Determination of Hormones in Drinking Water by LC/MS/MS Using an Agilent InfinityLab Poroshell HPH Column (EPA 539); Agilent Technologies, Inc., Application note 5991-6995EN, 2016.
2. Hindle R. Improved Analysis of Trace Hormones in Drinking Water by LC/MS/MS (EPA 539) using the Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS; Agilent Technologies, Inc., Application note 5991-2473EN, 2013.
3. Fiers T. et al. Development of a highly sensitive method for the quantification of estrone and estradiol in serum by liquid chromatography tandem mass spectrometry without derivatization. J. Chromatogr. B, 893-894 (2012), 57-62.