Metabolomics Analysis of Tuberculosis Drug Activity Using an Agilent 6545 Q-TOF LC/MS

Význam tématu

Pyrazinamid je klíčová frontová látka při léčbě tuberkulózy ale jeho mechanismus působení je dosud neúplně popsán a narůstající rezistence vyžaduje nové analytické přístupy. Metabolomická analýza poskytuje komplexní pohled na biochemické změny patogena pod vlivem léku a napomáhá odhalit cílové dráhy a mechanismy účinku.

Cíle a přehled studie / článku

Studie představuje vysoce výkonnou IP-RP Q-TOF LC/MS metodu pro biologicky nezkreslenou analýzu dopadu pyrazinamidu na metabolom Mycobacterium tuberculosis. Workflow kombinuje optimalizované chromatografické podmínky, sofistikovanou detekci a pokročilou softwarovou analýzu v Profinder a Mass Profiler Professional.

Použitá metodika a instrumentace

• Kultivace M tuberculosis na Durapore membránách při pH 6.6 (bakteriostatické) a 5.5 (baktericidní)
• Extrahování metabolitů chladným acetonitril methanol voda a mechanické lyzování
• Ion pairing reverzní fáze chromatografie se 40 °C kolonou ZORBAX Extend C18
• Agilent 1290 Infinity UHPLC systém s izokratickým elučním čerpadlem
• Detekce na Agilent 6545 Q-TOF s Dual ESI nebo AJS zdrojem
• Optimalizace iontového ladění pomocí Agilent SWARM Autotune
• Analýza dat v MassHunter Profinder pro cílenou extrakci a v MPP pro multivariační statistiku a mapování drah

Hlavní výsledky a diskuse

• Ladění 50–750 m/z v křehkém módu přineslo nejvyšší citlivost pro malé a labilní metabolity
• AJS zdroj významně zvýšil signály fosfátových a koenzymových metabolitů oproti konvenčnímu ESI
• Q-TOF dosáhl přesnosti hmotnosti pod ±1 ppm a nízkých chyb izotopových poměrů do 10 procent
• Z 111 cílových metabolitů bylo detekováno 73, z nich 54 vykazovalo statisticky významné změny pod vlivem PZA
• PCA a hierarchická klastrová analýza jasně rozlišily podmínky růstu a dávky PZA
• Mapování diferencovaných metabolitů ukázalo zásahy do biosyntézy pantothenátu a koenzymu A

Přínosy a praktické využití metody

Navržená metoda poskytuje robustní a citlivý přístup k průzkumu metabolomu patogenů pod chemoterapeutickou zátěží. Lze ji adaptovat na další antimikrobiální látky a používat v klinickém výzkumu rezistence a optimalizaci léčby.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace metabolomických dat s genomikou a proteomikou pro komplexní mechanistické studie
• Rozšiřování a zpřesňování databází metabolitů patogenních mikroorganismů
• Nasazení vysoce výkonných LC/MS metod v rutinní diagnostice rezistence a terapeutického monitoringu

Závěr

Optimalizovaná IP-RP Q-TOF LC/MS metoda s AJS zdrojem a pokročilou softwarovou analýzou umožňuje detailní a nezkreslenou charakterizaci metabolických změn M tuberculosis pod vlivem pyrazinamidu. Výsledky rozšiřují znalosti o mechanismu účinku a podporují vývoj nových antituberkulotik.

Reference

• Zhang Y a Mitchison D Int J Tuberc Lung Dis 2003 7 6 21
• Dai Y Profiling of Endogenous Metabolites Using Time-of-Flight LC/MS Agilent Application Note 5991-7802EN 2017
• Agilent 6545 Q-TOF Brochure 5991-5468EN 2015
• Mordehai A ASMS 2009 Poster MPM 331
• Agilent MassHunter Profinder Technical Overview 5991-3947EN 2014
• Kind T a Fiehn O BMC Bioinformatics 2006 7 234
• Xu Y et al Anal Chem 2010 82 5490-5501
• Zhang Y et al Microbiol Spectr 2013 2 4 1-12
• Gopal P et al ACS Infect Dis 2016 2 616-626