Precise Characterization of Intact Monoclonal Antibodies by the Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF

Význam tématu

Monoklonální protilátky patří mezi klíčové bioterapeutické molekuly, jejichž úplné a přesné charakterizaci je třeba vykonávat v každém kroku výrobního procesu. Analýza intaktních mAb poskytuje rychlé určení přesné molekulové hmotnosti a posouzení heterogenity způsobené posttranslačními modifikacemi, konjugací léčiva nebo degradačními produkty. Vysoká přesnost a rozlišení jsou zásadní pro zajištění kvality finálního produktu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem je představit integrované workflow využívající Agilent 1290 Infinity II UHPLC, Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF a software MassHunter BioConfirm pro automatizovanou analýzu intaktních mAb. Studie demonstruje schopnost přesně měřit molekulovou hmotnost, rozlišovat jednotlivé glykoformy, stanovovat poměr léčiva k protilátce (DAR) u ADC a porovnávat originální a biosimilární produkty.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: standardní mAb NIST RM 8671, Herceptin, ADC T-DM1, Rituximab (originál a biosimilár).
• Chromatografie: Agilent 1290 Infinity II UHPLC, kolona PLRP-S (2,1×50 mm, 5 µm), mobilní fáze A (0,1 % kyselina mravenčí/voda) a B (0,1 % kyselina mravenčí/acetonitril), lineární gradient 0–70 % B za 4 minuty, teplota kolony 60 °C, průtok 0,5 mL·min⁻¹, objem injekce 0,5 µL.
• Hmotnostní spektrometrie: Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s Dual JetStream zdrojem; teplota plynu 350 °C, proud 12 L·min⁻¹; proud plášťového plynu 11 L·min⁻¹; kapilární napětí 5500 V; rozsah m/z 100–10 000; akviziční režim pozitivní, rozšířený do 10 000 m/z, rychlost 1 spektrum·s⁻¹; referenční ion 922,0098 m/z.
• Datová analýza: MassHunter BioConfirm B.08, dekonvoluce pomocí algoritmu Maximum Entropy, průměrování nejvyšších 25 % signálů v rozsahu 2 000–5 000 m/z, dekonvoluce do rozsahu 140 000–160 000 Da.

Hlavní výsledky a diskuse

• Analýza NIST mAb: rozlišení a identifikace šesti hlavních glykoform s průměrnou chybou hmotnosti <0,5 ppm.
• Herceptin: obdobná přesnost měření glykoform, chyby v řádu jednotek ppm.
• ADC T-DM1: detekce devíti masových clusterů D0–D8, průměrný DAR 3,5 vypočtený BioConfirmem, v souladu s literaturou.
• Rituximab (originál vs biosimilár): přímé porovnání odchylek v dekonvoluovaných spektrách, prokazující vysokou shodu a možnost rychlé kontroly kvality srovnávacích produktů.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká hmotnostní přesnost na úrovni jednotek ppm umožňuje spolehlivé určení jednotlivých glykoform i minoritních modifikací.
• Krátký analytický cyklus (4min gradient) a automatické zpracování dat dovolují zpracování 96 vzorků za 8 hodin.
• Možnost stanovit DAR u ADC, sledovat heterogenitu a porovnávat originální a biosimilární přípravky v rámci kvalitativní kontroly.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na multiatributní metody (MAM) pro souběžný monitoring několika kritických atributů léčiv.
• Integrace strojového učení pro rychlejší a robustnější dekonvoluci a identifikaci vzácných modifikací.
• Využití ve vysokopropustných studiích stability, inline procesním monitoringu a nativní MS pro zachování konformačních vlastností.

Závěr

Popsané workflow kombinuje špičkové UHPLC, vysoce výkonnou Q-TOF hmotnostní spektrometrii a automatizované zpracování dat, čímž poskytuje rychlou, přesnou a citlivou metodu pro charakterizaci intaktních monoklonálních protilátek a ADC. Tento přístup přispívá ke zkrácení času analýzy a zlepšení kontroly kvality bioterapeutik.

Reference

1. Intact Protein Analysis Using an Agilent 6550 Q-TOF Mass Spectrometer. Agilent Technologies, publication number 5991-2116EN.
2. Analysis of Monoclonal Antibody (mAb) Using Agilent 1290 Infinity LC System Coupled to Agilent 6530 Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF). Agilent Technologies, publication number 5991-4266EN.
3. An Integrated Workflow for Automated Calculation of Antibody-Drug Conjugate (ADC) Drug-to-Antibody Ratio (DAR). Agilent Technologies, publication number 5991-7366EN.