High-Throughput Lead Discovery with Agilent RapidFire/MS Systems: Analysis of UDP-3-O-(R-3-hydroxymyristoyl)-NAcetylglucosamine Deacetylase (LpxC)

Význam tématu

LpxC je klíčový enzym v biosyntéze lipid A u gramnegativních bakterií a představuje významný cíl pro vývoj nových antibiotik. Tradiční screeningové přístupy často vyžadují značené surrogátní substráty s odlišnou kinetikou, což může vést k falešným pozitivům. RapidFire MS systém umožňuje přímou detekci nativních substrátů a produktů bez potřeby značení, čímž zvyšuje relevanci a rychlost analýzy.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo demonstrovat schopnost Agilent RapidFire highthroughput MS systému konvertovat nízkopropustný LpxC enzymový test do formátu vysokopropustného screeningu. Studie se zaměřila na přímou detekci deacetylace substrátu UDP-3-O-(R-3-hydroxymyristoyl)-N-acetylglucosamine katalyzované LpxC a srovnání výsledků s konvenčními fluorescenčními metodami využívajícími surrogát.

Použitá metodika a instrumentace

• RapidFire Highthroughput Mass Spectrometry System (Agilent Technologies)
• Pevnofázová extrakce (SPE) propojená přímo s MS detekcí
• Nativní substrát UDP-3-O-(R-3-hydroxymyristoyl)-N-acetylglucosamine
• Optimalizace podmínek pro lineární závislost tvorby produktu a stanovení kinetických parametrů (Km)

Hlavní výsledky a diskuse

• Prokázána lineární závislost tvorby produktu na koncentraci enzymu LpxC s rychlostí zpracování vzorku 6 až 10 s
• Získány standardní kinetické křivky umožňující určení Km pro nativní substrát bez použití surrogátu
• Screening náhodné knihovny identifikoval potenciální inhibitory LpxC potvrzené pomocí pětibodových dávkových odpovědí

Přínosy a praktické využití metody

• Přímá detekce nativních látek eliminuje potřebu značení a nevhodných surrogátních substrátů
• Vysoká rychlost zpracování vzorků umožňuje vysokopropustný screening obtížných cílů
• Snížení doby vývoje assay pro kinetická měření
• Objevení nových inhibitorů, které tradiční metody nemusí zachytit

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace RapidFire MS do fáze lead discovery pro širší škálu enzymatických cílů
• Rozšíření metody na další náročné proteiny s malými nativními substráty
• Automatizace a kombinace s in silico screeningem pro vyšší produktivitu
• Využití v průmyslové QAQC pro rychlou analýzu biologických produktů

Závěr

Agilent RapidFire highthroughput MS systém představuje efektivní a citlivou platformu pro screening a kinetická měření enzymů, které jsou obtížně sledovatelné tradičními metodami. Přímá detekce nativních látek, vysoká rychlost zpracování a kvalita dat otevírají nové možnosti v objevování léčiv.

Reference

1. Wang W et al Analytical Biochemistry 2001 290 338 346
2. Langsdorf E et al J Biomol Screen 2010 15 1 52 61