Structural Analysis of Glycosphingolipids by LC-IT-TOF-MS

Význam tématu

Glycosphingolipidy (GSL) jsou klíčovými komponentami buněčných membrán, kde zprostředkovávají interakce mezi buňkami, signalizaci a vazbu patogenů či toxinů. Jejich funkce je úzce svázána s mikrodoménami membrány, avšak komplexní strukturní charakterizace zejména stopových množství GSL byla dlouho omezená. Rozvoj účinných analytických metod pro detekci a strukturní analýzu GSL je proto zásadní pro pochopení biologických mechanismů a využití v biomedicíně.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem předkládané studie je představit metodu založenou na kapalinové chromatografii spojené s iontovým pastovým a časem letu hmotnostním spektrometrem (LC-IT-TOF-MS) pro komplexní detekci a strukturální charakterizaci glycosphingolipidů, zejména gangliosidů obsahujících kyselinu sialovou. Metoda byla aplikována na gangliosidy izolované z myších thymocytů, CD4+ a CD8+ T-lymfocytů, přičemž bylo možné rozlišit izomery a charakterizovat jak glykanovou, tak lipidovou složku.

Použitá metodika

Extrakce lipofilních GSL proběhla v systémech chloroform–metanol–voda s následnou dialýzou a slabě alkalickou hydrolýzou. Frakcionace kyselých lipidů se realizovala na DEAE–Sephadexu a C18 Sep-Pak cartridgi. Vzorky byly rozpouštěny v methanolu a injikovány do LC systému.

Použitá instrumentace

Analýza byla provedena na LC-IT-TOF-MS (Shimadzu), přičemž byla použita reverzní fáze na C30 kolóně (Develosil C30-UG-3) s elucí gradientem amonné soli a organických rozpouštědel a normální fáze na NH2 kolóně (Unison NH2). Detekce probíhala v negativním ionovém módu s nastavením CDL a tepelných bloků na 200 °C.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila oddělit a detekovat gangliosidy GM1, GD1 a jejich izomery GM1a/GM1b či GD1a/GD1b/GD1c v biologicky relevantních nízkých koncentracích. Z vlas­t­ního retenčního času a fragmentačních spekter MS2 a MS3 byly určeny charakteristické ionty glykanové (m/z 306,1 pro NeuNGc, m/z 775,2 pro NeuNGc–NeuNGc–Gal) i lipidové složky (d18:1-24:1, d18:1-22:0, d18:1-16:0). Porovnání thymocytů, CD4+ a CD8+ buněk odhalilo odlišné poměry ceramidových řetězců a specializované rozšířené struktury (např. GalNAc-GM1b a „extended“ GM1b) v závislosti na buněčné subpopulaci.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda LC-IT-TOF-MS poskytuje citlivou detekci a strukturní analýzu GSL i v komplexních směsích s trace úrovněmi analytů. Umožňuje sledovat složení mikrodomén, zkoumat vazby GSL a proteinů membrány a podporuje výzkum funkční glykolipidomiky, vývoj terapeutik a kvalitu analytických rutin v průmyslové a klinické praxi.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Vytváření databází MS spekter GSL pro automatizované vyhledávání.
• Rozvoj MRM metod pro kvantitativní sledování změn GSL v modelech onemocnění.
• Aplikace v oblasti inzulinové rezistence, neurodegenerativních onemocnění (Alzheimer, Parkinson) a epidermálních funkcí ceramidů.
• Studium genových knockout myších modelů glykozyltransferáz.

Závěr

LC-IT-TOF-MS byla ověřena jako výkonný nástroj pro komplexní strukturální analýzu glycosphingolipidů v biologických vzorcích. Umožňuje detailní charakterizaci kombinací glykanů a lipidů, identifikaci izomerů a kvantitativní srovnání buněčných typů, což otevírá nové směry ve výzkumu buněčné signalizace a vývoji aplikací v medicíně a biotechnologiích.

Reference

1. Simons K, Ikonen E (1997) Nature 387, 569–572
2. Nagafuku M et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E336–E342
3. Ikeda K, Taguchi R (2010) Rapid Commun. Mass Spectrom. 24, 2957–2965
4. Ikeda K, Shimizu T, Taguchi R (2008) J. Lipid Res. 49, 2678–2689
5. Kabayama K et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13678–13683
6. Yanagisawa K et al. (1995) Nat. Med. 1, 1062–1066
7. Mazzulli JR et al. (2011) Cell 146, 37–52