Glycerophospholipids Analysis by Comprehensive HPLC Coupled with a Triple Quadrupole Mass Spectrometer

Význam tématu

Glycerofosfolipidy představují základní stavební kameny buněčných membrán a zajišťují ochranu buňky i fungování signalizačních drah. Spolehlivá analýza těchto lipidů má zásadní význam pro výzkum metabolomiky a porozumění biochemickým procesům.

Cíle a přehled studie

Cílem studie je vyvinout a ověřit metodiku komplexní kapalinové chromatografie (HPLC) ve dvou dimenzích spojené s hmotnostní spektrometrií v módu ESI-MS/MS pro separaci a kvantifikaci hlavních tříd GPL. Studie předkládá princip multidimenzionálního rozdělení a ukazuje na odstranění potlačení ionizace způsobeného koeluujícími složkami.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika zahrnuje dvě chromatografické dimenze:

• 1D normální fáze s kolonou Nucleosil SIL (150×1,0 mm, 3 μm)
• Rozpouštědla: izooktan/acetone/ethylacetát/kyselina octová a izooktan/2-propanol/voda/kyselina octová/amoniak; průtok 0,02 mL/min; gradient 30–100 % fáze B v 40 minutách; teplota 40 °C; objem injekce 5 μL; smyčka 20 μL.
• 2D reverzní fáze UHPLC s kolonou Phenomenex Kinetex C18 (50×4,6 mm, 2,6 μm)
• Rozpouštědla: methanol/voda/kyselina octová/amoniak a 2-propanol/kyselina octová/amoniak; průtok 3,5 mL/min s 50% splitem do MS; gradient 10–50 % fáze B za 0,75 min; doba analýzy 1 min.

Detekce probíhala na přístroji Shimadzu LCMS-8050 v módu ESI pozitivní, MRM.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila rozdělení pěti hlavních tříd GPL (PG, PE, PI, PS, PC) v 2D chromatogramu bez ztráty vzorku. Opakovatelnost retenčních časů a plošných signálů byla lepší než 1,2 % RSD. Pro tři vybrané PC sloučeniny byla ověřena linearita v rozsahu 50–5000 µg/L s koeficientem korelace nad 0,9996. Výsledky demonstrují vysokou selektivitu a citlivost metody.

Přínosy a praktické využití metody

Vyvinutá technika poskytuje:

• Kompletní separaci heterogenních GPL bez vzájemného potlačení signálu
• Rychlou analýzu s vysokou reprodukovatelností
• Možnost kvantifikace nízkých koncentrací lipidů v komplexních biologických matricích

Tato metoda je vhodná pro výzkum metabolomiky, studium patologických stavů a kontrolu kvality v bioprodukčním průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalšími směry rozvoje jsou automatizace přepínání mezi dimenzemi, integrace s vyšším rozlišením hmotnostní analýzy a rozšíření na jiné třídy lipidů. Potenciál má nasazení v klinických studiích a personalizované medicíně.

Závěr

Komplexní HPLC-ESI-MS/MS ve dvou dimenzích představuje účinnou platformu pro separaci a kvantifikaci glycerofosfolipidů. Metoda překonává potlačení ionizace, nabízí vysokou přesnost a představuje perspektivu pro pokročilé aplikace v lipidomice.