Comprehensive two-dimensional HPLC analysis coupled with mass spectrometric detection and informative data processing for lipid analysis

Význam tématu

Analýza lipidů je klíčová pro pochopení struktury a funkce biologických membrán. Rozmanitost fosfolipidů a jejich podobných látek vyžaduje vysoce selektivní a citlivé metody pro separaci a identifikaci jednotlivých složek v komplexních biologických vzorcích. Kombinace dvourozměrné kapalinové chromatografie (2D LC) se hmotnostní spektrometrií (MS) nabízí řešení této výzvy díky orthogonální separaci a analytické výkonnosti.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentované práce bylo navrhnout a demonstrovat univerzální 2D LC-MS platformu pro komplexní analýzu glycerofosfolipidů (GPL). Studie se zaměřila jak na kvantitativní měření (triple kvadrupólový analyzátor), tak na kvalitativní identifikaci (ion trap-TOF MS) fosfolipidů s využitím dedikovaného softwaru pro zpracování dat.

Použitá metodika a instrumentace

Pro 2D separaci byl využit systém Nexera-e společnosti Shimadzu. První dimenze (1D) probíhala v mikroskopickém měřítku na normální fázi (Nucleosil SIL), kde se lipidy hrubě klasifikovaly. Eluáty se střídavě sbíraly ve dvou slučovacích smyčkách. Druhá dimenze (2D) probíhala vysokoúčinnou reverzní fází (Phenomenex Kinetex C18) v ultrarychlém režimu UHPLC.
MS detekce byla zajištěna:

• LCMS-8050 (triple kvadrupól, ESI pozit. režim, 31 MRM přechodů) pro kvantifikaci.
• LCMS-IT-TOF (ion trap-TOF, ESI pozit. i negat. režim, MSn a vysoká hmotnostní přesnost) pro kvalitativní identifikaci.

Data z LCMS-IT-TOF byla zpracována softwarovým balíčkem ChromSquare a lipidy byly automaticky přiřazeny pomocí databáze Lipid Search.

Hlavní výsledky a diskuse

Kvantitativní analýza GPL prokázala:

• Dobrou orthogonalitu separace pěti hlavních tříd fosfolipidů (PG, PE, PI, PS, PC).
• Vynikající opakovatelnost retenčních časů a plošných signálů (n=5, %RSD nízké jednotky).
• Lineární rozsah pro PC v koncentracích 50–5000 µg/L (r2 > 0,999).

V kvalitativní části byly ve skenovacím režimu ESI+: PC lipidy detekovány citlivěji, v ESI– převládaly PE a PG. Databázová analýza umožnila spolehlivou identifikaci kandidáta 16:0-20:4 PG na základě porovnání experimentálních a teoretických m/z hodnot a fragmentačních vzorů.

Přínosy a praktické využití metody

Dvourozměrná LC-MS platforma přináší:

• Rozšířenou separační kapacitu pro komplexní lipidové matice.
• Vysokou specifičnost a citlivost detekce fosfolipidů.
• Rychlé kvantitativní a kvalitativní vyhodnocení v jednom běhu.
• Automatizované zpracování dat a databázové přiřazení složek.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj v oblastech:

• Integrace s pokročilou lipidomikou pro širší spektrum lipidových tříd.
• Vyšší automatizace a zkrácení doby analýzy.
• Využití umělé inteligence pro rychlejší a přesnější identifikaci lipidů.
• Rozšíření databází a zlepšení podpory pro neobvyklé mastné kyseliny a izobarické sloučeniny.

Závěr

Prezentovaný 2D LC-MS systém pro analyzu glycerofosfolipidů spojuje orthogonální separaci s vysoce citlivou hmotnostní spektrometrií, což umožňuje robustní kvantifikaci a spolehlivou identifikaci složitých lipidových směsí. Metoda je vhodná pro výzkum, kontrolu kvality a další aplikace v lipidomice.

Reference

• Shimadzu Corporation. Comprehensive two-dimensional HPLC analysis coupled with mass spectrometric detection and informative data processing for lipid analysis. ASMS 2015, TP 259.