Glycerophospholipids Analysis by Two-Dimensional Liquid Chromatography Coupled with a Triple Quadrupole Mass Spectrometer

Význam tématu

Glycerofosfolipidy jsou kľíčové složky biologických membrán, podílejí se na buněčné signalizaci, transportu a strukturní integritě. V lipidomice je přesná identifikace a kvantifikace minoritních lipidních druhů zásadní pro pochopení biologických procesů a diagnostiku onemocnění. Konvenční RP HPLC s ESI MS však čelí potlačení iontů při analýze komplexních vzorků.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout a optimalizovat dvoudimenzionální chromatografii (2D-LC) spojenou s ESI MS/MS v módu MRM pro spolehlivou separaci a kvantifikaci glycerofosfolipidů. Metoda má minimalizovat vliv matrice, zlepšit citlivost a reprodukovatelnost oproti jednorozměrnému RP LC přístupu.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda kombinuje tři chromatografické etapy:

• 1. dimenze – normalní fáze na sloupci Shim-pack XR-SIL pro třídění lipidních tříd (PG, PI, PS apod.),
• online koncentrace a odstranění matrice na HILIC strážním sloupci COSMOSIL,
• 2. dimenze – reverzní fáze na L-Column ODS2 pro separaci jednotlivých molekul v rámci třídy,
• detekce ESI MS/MS na Shimadzu LCMS-8040 v módu multiple reaction monitoring.

Analytické podmínky zahrnovaly optimalizované gradienty vhodných mobile fazí, teplotu 40 °C a průtoky 0,15–2,1 mL/min.

Hlavní výsledky a diskuse

• V 1. dimenzi byly glycerofosfolipidy odseparovány dle třídy, frakce byla zachycena a koncentrována.
• Kalibrační křivky pro cílové sloučeniny vykázaly vynikající linearitu (r>0,999) a nízkou variabilitu (RSD <6 %).
• Studie vlivu matrice ukázaly, že konvenční RP LC vykazuje potlačení i zesílení signálu, zatímco 2D-LC eliminuje tyto interference a zajišťuje přesnou kvantifikaci.
• Srovnání poměru ploch píků pro vzorky se zvyšující se koncentrací matrice potvrdilo stabilitu a reprodukovatelnost 2D metody.

Přínosy a praktické využití metody

• Automatická koncentrace cílových lipidů bez manuálních zásahů.
• Odstranění nežádoucích složek matrice a minimalizace iontového potlačení.
• Spolehlivá kvantifikace v komplexních biologických vzorcích.
• Vhodné pro výzkum lipidomiky, biomedicínu a QA/QC v potravinářství či farmaceutickém průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metody na další lipidní třídy a polarní metabolity.
• Integrace s vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrií pro detailní analýzu izomerů a nenasytitostí.
• Automatizace a zvýšení propustnosti pro klinické a biomarkerové studie.
• Vývoj softwarových nástrojů pro zpracování komplexních dat lipidomiky.

Závěr

Navržený 2D-LC ESI MS/MS systém nabízí spolehlivou separaci a citlivou kvantifikaci glycerofosfolipidů v přítomnosti složité matrice. Metoda překonává omezení konvenční RP LC, poskytuje vynikající linearitu, reprodukovatelnost a odolnost vůči matrix effect, což jí předurčuje pro široké využití v analytické chemii a lipidomice.

Reference

• Nakayama D, Dong J, Yamabe K, Suzuki T, Hayakawa Y, Masuda J, Kunihiro O, Shimadzu Corporation 2013
• Projekt NEDO Fundamental Technology for Promoting Industrial Application of Human Stem Cells