Analysis of Water-Soluble Vitamins and their Metabolites - Performance Gains in Hydrophilic Interaction Chromatography (HILIC) with LC/MS/MS

Význam tématu

Komplexní stanovení vodou rozpustných vitaminů a jejich metabolitů je klíčové pro metabolomiku, klinickou diagnostiku, nutriční výzkum i kontrolu jakosti ve farmacii a potravinářství. Díky své vysoké polaritě vyžadují tyto látky speciální chromatografické přístupy, kterým vyhovuje hydrofobně interakční chromatografie (HILIC) ve spojení s LC/MS/MS.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo optimalizovat separaci a detekci 24 vodou rozpustných vitaminů a jejich fosforylovaných metabolitů pomocí Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z kolony a triple kvadrupólového LC/MS. Hlavním úkolem bylo prozkoumat vliv různých mobilních fází s odlišným pH, použití PEEK-lined hardware a deaktivátoru pro redukci interakcí s kovovými povrchy.

Použitá metodika a instrumentace

Pro analýzu byla zvolena systémová konfigurace Agilent 1290 Infinity II pumpa a autosampler, InfinityLab multicolumn termostat a Agilent 6460 triple kvadrupólový LC/MS s ESI ionizací. Jako stacionární fáze posloužila Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z kolona (2,1×100 mm, 2,7 µm) ve standardní i PEEK-lined variantě. Mobilní fáze obsahovala 10 mM amonného acetátu v kombinaci s acetonitrilem (mid-pH kolem 7), gradient běžel 0–1 min 100 % organiky, 1–8 min přechod na 50 % organiky, celková doba 10 min, průtok 0,30 mL/min, teplota kolony 40 °C, injekce 0,5 μL. K datové akvizici a zpracování byla použita MassHunter software.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace ukázala, že mid-pH mobilní fáze poskytuje nejlepší kompromis mezi retencí a rozlišením všech sloučenin. U fosforylovaných metabolitů docházelo k neostrému tvaru píků a ztrátám signálu při průchodu kovovými komponentami. Proti tomu bylo účinné vypláchnutí systému 0,5 % kyselinou fosforečnou v acetonitrilu:voda 90:10 a přidání InfinityLab deactivator additive, který selektivně pasivuje kovové povrchy. Dále PEEK-lined hardware přinesl dodatečné zlepšení tvaru píků a teoretického počtu destiček.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje spolehlivou a kvantitativní analýzu širokého spektra vodou rozpustných vitaminů a jejich metabolitů během 10 minut na jednom běhu. Je vhodná pro rutinní laboratoře, klinické i nutraceutické aplikace, kde je požadována vysoká citlivost, opakovatelnost a odolnost vůči kovovým interakcím.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace do vysokopropustných metabolomických workflow a automatizace přípravy vzorků.
• Rozšíření na kinetickou metabolomiku a monitorování dynamiky vitaminů v biologických matricích.
• Kombinace s high-resolution MS pro objasnění neznámých metabolitů a izobarických forem.
• Vývoj nových HILIC stacionárních fází a mikročásticových kolon pro zkrácení analýz a snížení spotřeby rozpouštědel.

Závěr

Studie potvrdila, že použití mid-pH amonného acetátu, systémového vyplachu kyselinou fosforečnou, deaktivátoru a PEEK-lined hardware významně zlepšuje separaci a kvalitu detekce vodou rozpustných vitaminů a metabolitů. Navržená metoda nabízí rychlý, citlivý a robustní analytický postup pro různé aplikační oblasti.

Reference

1. Hydrophilic Interaction Chromatography Method Development and Troubleshooting, Agilent Technologies Technical Overview, publication number 5991-9271EN, 2018.
2. InfinityLab Deactivator Additive User Guide, Agilent Technologies, publication number 5991-9516EN, 2018.