Automated Plasma Proteomic Sample Preparation

Význam tématu

Proteomika plazmy je zásadní pro odhalování biomarkerů a pochopení fyziologických i patologických procesů v klinických vzorcích. Díky vysokému dynamickému rozsahu koncentrací proteinů, malému objemu vzorku a složité pre‐analytické přípravě se však stala náročnou disciplínou. Automatizace a standardizace přípravy vzorků proto významně zvyšují přesnost, opakovatelnost a rychlost analýz, což je klíčové pro robustní porovnávání velkých kohort a statisticky spolehlivá data.

Cíle a přehled studie

Cílem prezentované studie bylo vyvinout a validovat zrychlený a robustní pracovní postup pro profilování proteomu plazmy, který je plně automatizovaný a zvládá kompletní pre‐analytickou přípravu od 1 µL vzorku plazmy až po čisté peptidy připravené k LC/MS/MS. Kombinace iST kitu od PreOmics a Agilent Bravo platformy umožňuje provést denaturaci, redukci, alkylaci, enzymatické štěpení i čištění peptidů v jednom kartridži během dvou hodin.

Použitá metodika

• Vzorky: 96 plazmatických vzorků (48 vzorků od jedné ženy a 48 od jednoho muže), získaných standardní srážkou krevní plazmy.
• Pre‐analytická příprava: iST kartridž pro realizaci lýzy, denaturace, redukce, alkylace a tryptické digesce v jedné reakční nádobce.
• Automatizace: Agilent Bravo pipetovací robot pro přesné dávkování a manipulaci se vzorky v 96-well formátu.
• Čištění peptidů: směsí organických a vodných roztoků k odstranění lipidů a solí v kartridžích iST.
• Analytika: 20minutové chromatografické gradienty LC/MS/MS pro vysokou propustnost.

Použitá instrumentace

• Agilent Bravo Liquid Handling Platform se 96ST pipetovací hlavou
• Teleshake Heated Shaking Station a Peltier Thermal Station pro řízenou inkubaci
• EASY-nLC 1000 ultra-vysokotlaký systém (Thermo Fisher Scientific)
• Q Exactive HF Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) s nanoelektrospray ionizací
• 40 cm HPLC kolony s ReproSil-Pur C18-AQ 1,9 µm pryskyřicí

Hlavní výsledky a diskuse

• Na 1 µL plazmy bylo průměrně kvantifikováno 300 proteinů na běh v rozsahu šesti řádů koncentrace.
• Průměrná Pearsonova korelace celého workflow pro technické replikáty dosáhla hodnoty 0,98, což dokládá vynikající reprodukovatelnost.
• Porovnání vzorků od různých jedinců odhalilo významné rozdíly v hladinách proteinů jako SHBG, PZP či imunoglobuliny.

Přínosy a praktické využití metody

• Kompletní příprava vzorku v jediné kartridži šetří čas a minimalizuje riziko kontaminace.
• Automatizace umožňuje paralelní zpracování stovek vzorků s vysokou přesností.
• Workflow vhodné pro velké klinické studie, longitudinální sledování pacientů a objevování biomarkerů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Moderní směřování proteomiky plazmy zahrnuje integraci s jinými omickými přístupy, zkracování analytických gradientů pro ještě vyšší throughput a využití strojového učení pro komplexní analýzu dat. Miniaturizace a further zefektivnění přípravy vzorků bude podporovat personalizovanou medicínu a rychlou diagnostiku.

Závěr

PreOmics iST technologie v kombinaci s Agilent Bravo platformou představují rychlý, robustní a vysoce reproducibilní přístup k přípravě plazmatických vzorků pro LC/MS/MS proteomiku. Metoda zkracuje čas přípravy na dvě hodiny, minimalizuje manuální zásahy a umožňuje spolehlivé kvantifikace stovek proteinů z minimálních objemů plazmy, což je nepostradatelné pro rozsáhlé klinické aplikace.

Reference

• Geyer P. E. et al. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology (2017) 13:942.
• Geyer P. E. et al. Plasma Proteome Profiling to Assess Human Health and Disease. Cell Systems (2016) 2(3):185–195.
• Kulak N. A. et al. Minimal, encapsulated proteomic-sample processing applied to copy-number estimation in eukaryotic cells. Nature Methods (2014).
• Anderson L. Six decades searching for meaning in the proteome. Journal of Proteomics (2014) 107:24–30.
• Cox J.; Mann M. MaxQuant enables high peptide identification rates… Nature Biotechnology (2008) 26(12):1367–1372.
• Cox J. et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. J. Proteome Res. (2011) 10(4):1794–1805.
• Cox J. et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by… Mol. Cell. Proteomics (2014) 13(9):2513–2526.