High-throughput plasma proteomics for translational biomarker discovery using PreOmics sample preparation and the Orbitrap Astral mass spectrometer

Význam tématu

Plazmatická proteomika je zásadní pro objev biomarkerů a klinický výzkum, protože krevní plasma odráží stav tkání a systémové signalizační procesy při minimální invazivitě odběru. Hlavní analytickou výzvou je extrémně široký dynamický rozsah koncentrací proteinů v plazmě, kdy vysokofrekventní proteiny potlačují detekci nízkohodiných, avšak biologicky důležitých markerů. V praxi proto záleží na kombinaci účinné, reprodukovatelné přípravy vzorku a vysoce citlivé masové spektrometrie, která umožní hloubkové mapování proteomu při škálovatelnosti pro větší kohorty.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem technické poznámky bylo vyhodnotit a porovnat tři PreOmics přípravné workflow (iST-BCT, ENRICH-iST, ENRICHplus) v kombinaci s Vanquish Neo UHPLC a Orbitrap Astral MS pro analýzu lidské plazmy z klinicky relevantních vzorků (zdraví jedinci, Alzheimerova choroba, nemalobuněčný karcinom plic, kolorektální karcinom). Hlavní oblasti hodnocení zahrnovaly reprodukovatelnost přípravy, analytickou přesnost kvantifikace, hloubku pokrytí proteomu a schopnost odhalit biologicky relevantní rozdíly mezi skupinami.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Vzorky: K2EDTA plazma z BioIVT, single-spun pro většinu skupin, double-spun pro část kolorektálních vzorků.
• Příprava: Dodrženy standardní protokoly PreOmics pro iST-BCT (1.5 µL plazmy), ENRICH-iST (20 µL) a ENRICHplus (50 µL). Enzymatická digesce 3 h na ThermoMixer C, vysušení SpeedVac a resuspense v 98% H2O/2% ACN/0.1% FA; normalizace na 100 ng/µL peptidek.
• Chromatografie a MS: Vanquish Neo v konfiguraci trap-and-elute, EASY-Spray C18 analytický sloupec (150 µm × 15 cm, 2 µm), PepMap Neo trap. Gradienty a LC parametry optimalizovány pro vysokou propustnost. Mass spectrometr: Orbitrap Astral v režimu DIA, MS1 rozlišení 240k, GPF (gas phase fractionation) experimenty s rozdělením MS1 rozsahu do šesti segmentů (380–980 m/z po 100 m/z) a úzkými MS2 okny (1 m/z) pro GPF knihovny.
• Softwarové zpracování: Biognosys Spectronaut v19 (directDIA + GPF chromatogram libraries), databáze UniProt human (staženo 2024-07-29), filtrování 1% FDR na úrovni prekurzoru i proteinové skupiny. Downstream analýzy v R (RStudio).

Instrumentace (samostatná sekce):

• Vanquish Neo UHPLC System (Thermo Scientific)
• Orbitrap Astral mass spectrometer (Thermo Scientific)
• ThermoMixer C (Eppendorf) pro digesci
• Savant SpeedVac Concentrator (Thermo Scientific)
• PepMap Neo trap cartridge a EASY-Spray analytický sloupec (Thermo Scientific)

Hlavní výsledky a diskuse

Hloubka pokrytí a kvantifikační přesnost:

• Průměrně identifikované proteinové skupiny v poolu zdravých donorů: iST-BCT 1 124, ENRICH-iST 2 027, ENRICHplus 3 178 (po triplikátech injekcí). Celkově přes celý soubor: iST-BCT 1 413, ENRICH-iST 2 972, ENRICHplus 4 438 proteinových skupin.
• Kvantitativní přesnost: peptide %CV: iST-BCT 12.0%, ENRICH-iST 13.6%, ENRICHplus 17.4%; proteinové skupiny %CV: iST-BCT 9.5%, ENRICH-iST 9.5%, ENRICHplus 10.5%.

Dynamický rozsah a dopad enrichmentu:

• ENRICH workflowy zvýšily detekci nízko- a středně abundantních proteinů ve srovnání s neat plasma (iST-BCT), což rozšiřuje cílový prostor pro biomarkery (včetně tkáňových „leakage“ a signálních proteinů).
• Rank ploty ukázaly, že mnoho nízko abundantních proteinů je unikátních pro ENRICH-based metody, přičemž celkové pořadí množství proteinů zůstává konzervativní.

Výhoda GPF a knihoven:

• Použití GPF při tvorbě chromatogramových knihoven (directDIA + GPF) zvýšilo počet peptidů v knihovnách o 11.4–20.6% (v závislosti na metodě) a proteinových skupin o 14.5–33.6%, s největším nárůstem u iST-BCT.
• Při hledání dat s těmito knihovnami došlo k nárůstu identifikací peptidů o 3.7–16.5% a proteinových skupin o 4.4–17.5% napříč experimenty.

Biologická sonda na NSCLC vs. zdraví:

• Po korekci FDR bylo detekováno 157 (iST-BCT), 355 (ENRICH-iST) a 548 (ENRICHplus) diferencovaně abundantních proteinů v NSCLC vs. kontrolní skupině.
• Z 24 kandidátů společných pro všechny tři metody vykázaly log2 fold change hodnoty velmi vysokou korelaci pro ENRICH-iST vs. iST-BCT (Pearson r = 0.96), zatímco korelace ENRICHplus s ostatními byla nižší (r ≈ 0.71–0.72), což naznačuje, že ENRICH-iST zachovává biologický signál s minimálním biasem zatímco ENRICHplus rozšiřuje detekci.
• Částečné překryvy differentialních kandidátů ukázaly vysokou konzistenci mezi iST-BCT a ENRICH-iST (r = 0.94) a větší množství překryvů mezi ENRICH-iST a ENRICHplus, avšak s nižšími korelacemi, implicující odlišné obohacovací preference.
• Pathway analýzy (GO, KEGG, Reactome) šly napříč metodami za stejnými třídami biologických procesů, což podporuje zachování biologického kontextu i po enrichmentu.

Přínosy a praktické využití metody

• Workflowy PreOmics v kombinaci s Orbitrap Astral nabízejí škálovatelný a plně automatizovatelný přístup pro klinické kohortní studie s vysokou propustností.
• ENRICH-iST představuje kompromis mezi hloubkou pokrytí a věrností kvantifikace — výrazně rozšiřuje detekci nízkých abundance proteinů a přitom dobře zachovává biologické rozdíly oproti neat plazmě.
• ENRICHplus maximalizuje hloubku pokrytí a detekci kandidátních biomarkerů, což je užitečné v raných fázích objevování, avšak s mírně vyšší variabilitou a odlišnou selektivitou obohacení.
• Implementace GPF chroma‑knihoven zlepšuje citlivost DIA analýzy a počet identifikací bez nutnosti rozsáhlé frakcionace.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrované přístupy kombinující automatizovanou přípravu (ENRICH), rychlé UHPLC separace a vysoce citlivé Orbitrap detektory budou klíčové pro postup k rutině ve velkých translací studiích a validaci biomarkerů.
• Dále lze očekávat rozvoj sample-specific chromatogramových knihoven a multifázového GPF k dalšímu zvýšení citlivosti pro vzácné peptidy a PTM.
• Optimalizace pre-analytiky a standardizace obohacovacích podmínek jsou nutné pro minimalizaci biasu při srovnávání mezi laboratořemi a studiemi.
• Potenciál pro aplikace zahrnuje longitudinální biomarkerové studie, farmakoproteomiku a personalizovanou medicínu, kde detekce nízko abundantních signálních proteinů je kritická.

Závěr

Studie předvádí, že spojení PreOmics iST/ENRICH workflowů s Vanquish Neo a Orbitrap Astral poskytuje robustní, reprodukovatelný a škálovatelný end‑to‑end přístup pro hloubkovou plazmatickou proteomiku. ENRICH-iST nabízí výborný kompromis mezi rozsahem pokrytí a zachováním kvantitativní integrity, zatímco ENRICHplus maximalizuje detekci nízko abundantních proteinů pro objev biomarkerů. Použití GPF při tvorbě knihoven dále zvyšuje identifikace a hloubku proteomu a podporuje širší využití v translational research.

Reference

1. Ignjatovic V, Geyer PE, Palaniappan KK, Chaaban JE, Omenn GS, Baker MS, Deutsch EW, Schwenk JM. Mass Spectrometry-Based Plasma Proteomics: Considerations from Sample Collection to Achieving Translational Data. J Proteome Res. 2019;18(12):4085–4097.
2. Anderson NL, Anderson NG. The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects. Mol Cell Proteomics. 2002;1(11):845–867.
3. Geyer PE et al. The Circulating Proteome—Technological Developments, Current Challenges, and Future Trends. J Proteome Res. 2024;23(12):5279–5295.
4. Korff K et al. Pre-Analytical Drivers of Bias in Bead-Enriched Plasma Proteomics. bioRxiv. 2025.
5. Searle BC et al. Chromatogram libraries improve peptide detection and quantification by data independent acquisition mass spectrometry. Nat Commun. 2018;9(1):5128.