Size Exclusion Chromatography Method Development of NIST mAb Using an Agilent AdvanceBio SEC 200 Å 1.9 μm Column

Význam tématu

Velikostní vylučovací chromatografie (SEC) je klíčovou technikou pro charakterizaci monoklonálních protilátek a dalších biotechnologických proteinů. Vývoj optimální chromatografické metody umožňuje přesné rozlišení monomeru, dimeru a vysokomolekulárních agregátů, což je nezbytné pro zajištění kvality a bezpečnosti bioterapeutik.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a optimalizovat SEC metodu pro standardní NIST monoklonální protilátku (RM 8671) pomocí kolony Agilent AdvanceBio SEC 200 Å 1,9 µm a bio-inertního LC systému Agilent 1260 Infinity II. Pomocí softwaru Buffer Advisor bylo možné online konfigurovat a testovat různé kombinace fosfátového pufru, NaCl a pH.

Použitá metodika a instrumentace

• LC systém: Agilent 1260 Infinity II bio-inert s quaternárním pumpou G5654A, multisamplerem G5668A, multikolonním termostatem G7116A a VWD detektorem G7114A (UV 280 nm).
• Kolona: Agilent AdvanceBio SEC 200 Å 1,9 µm, 4,6 × 300 mm.
• Software: Agilent OpenLab CDS 2.2, Agilent Buffer Advisor pro výpočet mobilních fází.
• Mobilní fáze: voda, 1 M NaCl, 245 mM NaH2PO4, 420 mM Na2HPO4.

Hlavní výsledky a diskuse

Byly otestovány fosfátové pufry v rozsahu 25–350 mM s a bez NaCl (200–250 mM) při pH 6,6–7,4. Klíčová zjištění:

• Při 150 mM fosfátu bez NaCl bylo nejvýhodnější pH 7,4, nicméně HMW% mírně převyšovalo referenční hodnotu.
• Přidání 250 mM NaCl umožnilo snížit fosfát na 50 mM a získat přesné HMW% při pH 6,8 bez ztráty rozlišení.
• Optimální podmínky: 50 mM fosfátu, 250 mM NaCl, pH 6,8 – vyvážená symetrie píků, vysoké rozlišení dimer/monomer a korektní kvantifikace agregátů.

Přínosy a praktické využití metody

Navržená metoda zkracuje vývoj chromatografických podmínek, zvyšuje reprodukovatelnost analýzy bioterapeutik a zajišťuje spolehlivou detekci a kvantifikaci agregátů. Bio-inertní systém minimalizuje interakce analyzovaných proteinů s povrchem přístroje.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj by mohl zahrnovat plnou automatizaci vývoje mobilních fází, aplikaci alternativních iontových pufrů, integraci s hmotnostní spektrometrií pro detailní rozbor variant a rozšíření metody na další proteiny a biologické matrix.

Závěr

Studie potvrdila, že kombinace Agilent AdvanceBio SEC kolony, bio-inertního LC systému a Buffer Advisor softwaru umožňuje efektivní vývoj SEC metod pro NIST mAb. Doporučené podmínky (50 mM fosfát, 250 mM NaCl, pH 6,8) poskytují optimální analytické parametry.

Reference

1. Schiel J. E.; et al. The NISTmAb Reference Material 8671 value assignment, homogeneity, and stability. Anal. Bioanal. Chem. 2018, 410, 2127–2139.