Helpful ‘Hints’ for Protein SEC Success

Význam tématu

Proteiny jsou biologicky nestabilní a náchylné k agregaci či fragmentaci, což může ovlivnit jejich účinnost či vyvolat imunologickou reakci. Velikostní exkluzní chromatografie (SEC) je zásadní analytická metoda pro kvantifikaci a charakterizaci těchto forem, protože separuje molekuly podle hydrodynamického objemu v roztoku za netečných podmínek.

Cíle a přehled studie

Cílem dokumentu „Helpful Hints for Protein SEC Success“ je poskytnout praktické pokyny pro optimální nastavení a provoz SEC při analýze proteinů. Obsah prezentuje definice, výběr kolony, přípravu mobilní fáze, detekční systémy a doporučení pro použití LC přístrojů.

Použitá metodika a instrumentace

• Metoda: Size Exclusion Chromatography s isokratickou elucí v hydrodynamicky netečném režimu.
• Kolony: Agilent AdvanceBio SEC (120Å, 200Å) a Bio SEC (100–1000Å), monolitické i křemíkové kolonové materiály.
• Mobilní fáze: fosfátový pufr (50–350 mM NaH₂PO₄), NaCl (0–250 mM), pH 6.6–7.4, naředěná ve vodě.
• Detektory: UV/DAD (220 nm), MALS (light scattering), refraktometr.
• Systémy: Agilent 1260 Infinity Bio-Inert LC, Agilent Buffer Advisor pro automatizaci přípravy pufrů.
• Příslušenství: Quick Connect fitinky, inline filtry (0.2–0.5 µm), solvent inlet filtry.

Hlavní výsledky a diskuse

• Optimalizace pórů: Pro monoklonální protilátky je nejlepší volba pór 200–300 Å, který zajišťuje dostatečnou separaci monomer–dimer–agregát.
• Porovnání kolony: AdvanceBio SEC 200 Å 1.9 µm prokázala širší separační okno (pórový objem 5.8 min) a vyšší účinnost (N ≈ 88 839) oproti konkurentům.
• Rychlá SEC: 7.8×150 mm AdvanceBio SEC 300 Å 2.7 µm dosáhla srovnatelné separace 2.3× rychleji než tradiční 300 mm kolona.
• Mobilní fáze: Nejlepší poměr tvaru píků a rozlišení dimer/monomer (Rs ≈ 2.35) při 150 mM fosfátu pH 7.0 + 0.15 M NaCl.
• Robustnost: Agilent Buffer Advisor zrychluje a automatizuje screening pH, koncentrace pufru a soli.

Přínosy a praktické využití metody

SEC umožňuje neinteraktivní, reprodukovatelné stanovení čistoty a agregace proteinů. Vyšší propustnost zkracuje dobu analýzy a snižuje spotřebu rozpouštědel. Bio-inertní systém a inertní chemie zajišťují stabilní retence a tvar píků.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace light-scattering detekce a hmotnostní spektrometrie pro detailní charakterizaci agregátů.
• Vývoj nových stacionárních fází s monolitickými materiály a optimalizovanou porézností pro ultra-rychlé separace.
• Automatizace přípravy mobilních fází a pokles manuální práce pomocí software pro návrh metod.
• Adaptace SEC na online coupling s dalšími technikami (MALS, MS).

Závěr

Správná volba pórů, částicového rozměru, rozměrů kolony, složení mobilní fáze a detektorů ve spojení s robustní LC instrumentací je klíčová pro úspěšný SEC rozbor proteinů. Produkty Agilent AdvanceBio SEC poskytují vynikající rozlišení, efektivitu a životnost.

Reference

• Lane J. Helpful ‘Hints’ for Protein SEC Success. Agilent Technologies, May 27, 2020.