SEC Method Transfer from Diol Chemistry to Polymer-Coated Silica

Význam tématu

V biotechnologii a farmaceutickém průmyslu je stanovení agregací proteinů klíčové pro kvalitu a bezpečnost léčiv, zejména monoklonálních protilátek. Velikostně vylučovací chromatografie (SEC) patří k nejspolehlivějším metodám pro monitorování agregátů díky své schopnosti separovat molekuly podle hydrodynamického objemu bez denaturace. Moderní kolonové technologie s nízkou nespecifickou vazbou jsou nezbytné pro minimalizaci interakcí s povrchem a dosažení reprodukovatelné analýzy proteinů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo porovnat starší diol-vázané kolonové fáze Agilent ZORBAX GF-250 a GF-450 s novými polymerově modifikovanými křemičitými AdvanceBio SEC 130 Å a 300 Å. Proces zahrnoval optimalizaci podmínek mobilní fáze a přenos existujících metod na novou kolonovou technologii. Pro hodnocení separačního výkonu byly použity referenční směsi proteinů a peptidů o různých molekulových hmotnostech, včetně inzulinu z bovinního pankreatu.

Použitá metodika a instrumentace

• Kapalinový chromatograf: Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary Pump, autosampler, termostatizovaný sloupcový komorový modul a diodový array detektor.
• Kolonové fáze:
  • AdvanceBio SEC 300 Å, 7,8×300 mm, 2,7 µm, polymer-coated silica.
  • AdvanceBio SEC 130 Å, 7,8×300 mm, 2,7 µm.
  • ZORBAX GF-250, 9,4×250 mm, 4 µm, diol-bonded.
  • ZORBAX GF-450, 9,4×250 mm, 6 µm.
• Referenční standardy: Thyreoglobulin, IgG monomer a dimer, ovalbumin, myoglobin, angiotensin II, aprotinin, neurotensin; inzulin (MW 5,7 kDa).
• Podmínky mobilní fáze: fosfátový buffer pH 7,0 (50–600 mM), NaCl (50–500 mM); průtok 1–1,2 mL/min, teplota kolon 25 °C, detekce 220 nm.

Hlavní výsledky a diskuse

• AdvanceBio SEC 300 Å vykázala nejlepší separaci 6-proteinové směsi s rozlišením IgG monomer/dimer 1,83 a nejnižším tailing faktorem angiotensinu II (1,07).
• AdvanceBio SEC 130 Å zajistila bázické rozlišení 5-proteinové 130 Å směsi a optimální tvar špičky inzulinu (TF 1,74), zatímco ZORBAX GF-250 vykazovala deformované špičky.
• ZORBAX GF-250 a GF-450 vyžadovaly vyšší koncentrace fosfátového bufferu až 600 mM a dosáhly nižšího rozlišení a vyššího tailing faktoru.
• Menší částice AdvanceBio kolony (2,7 µm) vedly k vyššímu zpětnému tlaku až 180 bar, ale umožnily zkrátit dobu analýzy a snížit spotřebu mobilní fáze.

Přínosy a praktické využití metody

• Polymerově potažené kolony poskytují vyšší selektivitu, opakovatelnost separací a lepší tvar špiček proteinů a peptidů.
• Zrychlené eluce a optimalizovaná mobilní fáze snižují spotřebu reagencií, zkracují dobu analýzy a šetří laboratorní náklady.
• Metoda usnadňuje přenos stávajících SEC postupů na pokročilé kolonové technologie bez ztráty citlivosti a reprodukovatelnosti.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Hyphenace SEC s hmotnostní spektrometrií pro hlubší charakterizaci variací proteinů a agregátů.
• Další vývoj stacionárních fází s minimální nespecifickou vazbou a širším rozsahem pórů pro analýzu nestandardních biologických makromolekul.
• Automatizace přípravy vzorků a vysokokapacitní SEC platformy pro screening biologických přípravků.

Závěr

AdvanceBio SEC 130 Å a 300 Å kolony s polymerovým potahem výrazně zlepšují separační výkon oproti diol-vázaným ZORBAX kolonám. Nabízejí vyšší rozlišení, lepší tvar špiček a efektivnější spotřebu mobilní fáze, což usnadňuje kontrolu kvality proteinových léčiv v moderních bioanalytických laboratořích.

Reference

1. Hong P., Koza S., Bouvier E.S.P. Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and Their Aggregates. Journal of Liquid Chromatography and Related Technologies. 2012;35(20):2923–2950.
2. Lagassé H.A. et al. Recent advances in (therapeutic protein) drug development. F1000 Research. 2017 Feb 7.
3. Lau J.L., Dunn M. Therapeutic peptides: Historical perspectives, current development trends, and future directions. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 2018 Jun;26(10):2700–2707.
4. Aggregation of Monoclonal Antibody Products: Formation and Removal. BioPharm International. 2013 Mar;26(3).
5. ADC Targets Fail Because of Aggregation Problems. Pharmaceutical Technology. 2017 Nov 14.