Mobile Phase Optimization in SEC Method Development

Význam tématu

Size exclusion chromatography (SEC) je zlatým standardem v detekci agregátů a degradovaných forem terapeutických proteinů, zejména monoklonálních protilátek (mAb) a souvisejících konjugátů. Správná volba mobilní fáze minimalizuje sekundární interakce se stacionární fází, zabraňuje indukci agregace během analýzy a zajišťuje přesné stanovení monomerů, dimerů a vyšších agregátů, což je klíčové pro kvalitu, účinnost a bezpečnost biofarmaceutik.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem Application Note je ukázat optimalizaci složení mobilní fáze pro SEC analýzu standardních směsí proteinů na sloupcích Agilent AdvanceBio SEC (300 Å a 130 Å). Studie hodnotí vliv koncentrace fosfátového pufru a přítomnosti NaCl na tvar a rozlišení píků u vzorků human IgG, ADC mimic, insulinu, cytochromu c, myoglobinu a polysacharidových standardů. Dále je demonstrováno použití sloupcového uspořádání v tandemu pro zvýšení rozlišení.

Použitá instrumentace

• Agilent AdvanceBio SEC 300 Å, 7.8 × 300 mm, 2.7 µm (p/n PL1180-5301)
• Agilent AdvanceBio SEC 130 Å, 7.8 × 300 mm, 2.7 µm (p/n PL1180-5350)
• LC systém Agilent 1260 Infinity bio-inert quaternary pump (G5611A) a autosampler (G5667A)
• Thermostat sloupce Agilent 1290 Infinity (G1316C), DAD detektor Agilent 1260 Infinity (G1315C)

Použitá metodika

• Mobilní fáze: fosfátový pufr pH 7.0 (50–600 mM), s dodatečnými experimenty s NaCl (50–500 mM) při 150 mM fosfátu
• Průtok 1 mL/min, teplota kolony 25 °C, chiller 4 °C, detekce při 220 nm
• Vzorky: human IgG, SigmaMAb ADC mimic, bovinní insulin, bovinní cytochrom c, koněcí myoglobin, Bio-Rad gel filtration standard, pullulanové polysacharidové standardy
• Injekce: 10 µL 1 mg/mL roztoku
• Experimenty s různou délkou kolony (7.8 × 150 mm, 7.8 × 300 mm, dvě kolony 300 Å v tandemu)

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace fosfátové koncentrace pro většinu proteinů ukázala, že 150 mM fosfátu pH 7.0 poskytuje nejnižší faktor ohonu a nejlepší rozlišení monomer / dimer u IgG a ADC mimic. Vyšší koncentrace (400–600 mM) způsobovaly indukovanou agregaci IgG a širší špičky u ADC.

Insulin vykazoval krušné tvary špiček při vyšších fosfátových koncentracích, nejlepší tvar a ostrost špičky bylo dosaženo opět kolem 150 mM. Cytochrom c naopak vykazoval méně ohonu a lepší obnovu při vyšších fosfátových koncentracích (400–600 mM), což naznačuje různé mechanizmy sekundárních interakcí.

Přidání NaCl k 150 mM fosfátu nemělo výrazný přínos pro tvar špiček ADC a insulinu, ale zvyšovalo agregaci IgG a narušovalo retenci cytochromu c při nízkých koncentracích. Doporučená složení mobilní fáze proto v drtivé většině případů neobsahují sůl.

Pro zvýšení rozlišení při analýze komplexních směsí (gel filtration standard, IgG, myoglobin, polysacharidy) lze využít zapojení dvou kolone v tandemu. Tento přístup zvýšil hodnoty rozlišení (např. z Rs ≈ 2.3 na Rs ≈ 3.1 u standardu gel filtration), ale za cenu vyššího tlaku a delší doby analýzy.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizovaná metodika umožňuje věrné stanovení monomerů, dimerů a agregátů terapeutických proteinů bez umělé indukce agregace či špatných tvarů špiček. Metoda je vhodná pro vývoj a kontrolu kvality biopharma procesů, kde jsou agregace klíčovým atributem kvality.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozvoj UHPLC-SEC sloupců s ještě menšími částicemi a vyšším tlakem pro rychlejší analýzy
• Integrované detekční systémy (MALS, DLS, hmotová spektrometrie) pro přesné stanovení molekulové hmotnosti a konstituce agregátů
• Automatizace přípravy mobilních fází a inline úprava pH pro kontinuální kontrolu stability vzorků
• Vyšší důraz na biologicky šetrné bio-inertní systémy pro minimalizaci adsorpce proteinů

Závěr

Systematická optimalizace fosfátové koncentrace a vynechání nadbytečné soli vedla ke stabilním, opakovatelným SEC metodám pro analýzu terapeutických proteinů. Pro většinu analyzovaných vzorků je doporučeno 150 mM fosfátu pH 7.0 bez přídavku NaCl. Zapojení kolone v tandemu nabízí další zvýšení rozlišení tam, kde je klíčová maximální separace směsí s širokým rozsahem velikostí.

Reference

1. Ecker D. M.; Jones S. D.; Levine H. L. The therapeutic monoclonal antibody market, MAbs 2015, 7(1), 9–14.
2. Lagassé H. A. D.; et al. Recent advances in (therapeutic protein) drug development, F1000Res 2017, 6, 113.
3. Hong P.; Koza S.; Bouvier E. S. P. Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and their Aggregates, J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 2012, 35(20), 2923–2950.
4. BioPharm International. Aggregation of Monoclonal Antibody Products: Formation and Removal, 2013, 26(3).
5. ADC Targets Fail Because of Aggregation Problems, PharmTech 2017, Nov 14.
6. Yu C. M.; Mun S.; Wang N. H. Phenomena of insulin peak fronting in size exclusion chromatography and strategies to reduce fronting, J. Chromatogr. A 2008, 1192(1), 121–129.