Analysis of Bile Acids by HPLC with ELSD using the Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 LC Column

Význam tématu

Bile kyseliny jsou klíčovými biomarkery v klinickém výzkumu a diagnostice onemocnění jater, žlučových cest a metabolických poruch. Analýza jak konjugovaných, tak nekonjugovaných forem si vyžaduje citlivou a robustní chromatografickou metodu, která zvládne rozlišit komplementární struktury a zároveň odolat náročnému složení biologických vzorků.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo optimalizovat HPLC metodu s detekcí ELSD pro separaci 14 typů žlučových kyselin a cholesterolu. Studie porovnávala Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 kolony o průměru částic 4 µm (4.6 × 250 mm) a 2.7 µm (4.6 × 100 mm), přičemž sledovala dobu analýzy, rozlišení a tlak v systému.

Použitá metodika

Reagencie a příprava vzorku:

• Rozpouštědla HPLC kvality (metanol, acetonitril), voda s 20 mM amonným acetátem
• Standardní roztoky žlučových kyselin a cholesterolu v metanolu (1 mg/ml), smíchané na finální koncentraci ~70 µg/ml

Chromatografické podmínky:

• Mobilní fáze A: 20 mM amonný acetát ve vodě
• Mobilní fáze B: acetonitril : metanol (60 : 40)
• Gradient: 0–2 min 40 % B, 2–8 min lineárně na 60 % B, 8–10 min 100 % B
• Průtok 1,5 ml/min, teplota kolony 60 °C, objem injekce 4 µl (100 mm kolona) nebo 10 µl (250 mm kolona)

Detekce ELSD:

• Teplota odpařovače 80 °C, teplota nebulizéru 30 °C, proud dusíku 1,60 SLM

Použitá instrumentace

• HPLC systém Agilent 1290 Infinity II (pumpa G7120A, multisampler G7167B, termostat G7116B)
• Detektor ELSD Agilent 1290 Infinity II (G7102A)
• Software Agilent OpenLab CDS C.01.07

Hlavní výsledky a diskuse

Kolona 4 µm dosáhla baseline separace všech 15 sloučenin za 32 minut. Přechod na kratší kolonu 2.7 µm zkrátil analýzu na 13 minut při zachování rozlišení. Superficiálně porézní částice zvýšily efektivitu oproti tradičním 5 µm částicím a nižší tlak eliminoval riziko ucpání frit. Vyšší teplota kolony (60 °C) optimalizovala rozlišení klíčových špiček a ovlivnila jejich vzájemné pořadí.

Přínosy a praktické využití metody

Tento HPLC-ELSD postup nabízí rychlou, citlivou a reprodukovatelnou separaci žlučových kyselin v biologických vzorcích (žluč, sérum, moč). Metoda se hodí pro klinické a průmyslové laboratoře zaměřené na QA/QC, metabolomiku i farmacokinetické studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s hmotnostní spektrometrií pro strukturní potvrzení a kvantifikaci
• Další miniaturizace a zkrácení analýzy v rámci UHPLC standardů
• Automatizace přípravy vzorků a vysokopropustné screeningové aplikace
• Rozšíření spektra cílových metabolitů v odborné klinické praxi

Závěr

Optimalizace HPLC-ELSD metody s použitím Agilent Poroshell kolony vykázala vynikající poměr rychlosti, rozlišení a robustnosti. Kratší 2.7 µm kolona umožnila značné úspory času a rozpouštědla při zachování analytické výkonnosti.

Reference

• Fu R., Lei J., Agilent Technologies (2019): Analysis of Bile Acids by HPLC with ELSD using the Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 LC Column, Application Note 5994-0807EN.