Improving the annotation of bile acids in fecal samples using a Liquid Chromatography-Ion Mobility-High Resolution Mass Spectrometry method

Význam tématu

Žlučové kyseliny jsou klíčovými metabolity odvozenými od cholesterolu a podílejí se na trávení tuků, regulaci metabolismu i patofyziologii onemocnění, jako je diabetes či rakovina tlustého střeva. Jejich přesná identifikace a kvantifikace v komplexních biologických vzorcích představuje analytickou výzvu z důvodu jejich podobné struktury, izobarických a izomerických forem.

Cíle a přehled studie

Práce představuje vývoj a optimalizaci čtyřrozměrné chromatograficko-hmotnostní metody (UHPLC-TIMS-HRMS) pro zvýšení spolehlivosti anotace 32 žlučových kyselin ve vzorcích stolice a séra. Studie se skládá ze dvou částí:

• Vývoj a validace analytické metody pro standardní směs 32 žlučových kyselin.
• Aplikace metody na profilování žlučových kyselin v lyofilizované stolici, vodných extraktech stolice a lidském séru.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky byly extrahovány směsí H2O:isopropanol:acetonitril (2:1:1, v/v/v) a do roamingu vstupovaly lyofilizované a vodné extrakty stolice a sérová plazma. Chromatografie probíhala na kolonce Waters Acquity BEH C8 (100×2,1 mm, 1,7 µm) s gradientní elucí dle upraveného protokolu Sarafian et al. (solvent A: acetonitril:H2O 10:90 + 10 mM formiátu, pH 4,2; B: acetonitril:2-propanol 50:50).

Použitá instrumentace

• TIMS-TOF (Bruker Daltonics) s ESI zdrojem pro negativní ionizaci.
• Software: Compass HyStar v6.0, Compass Data Analysis v5.3, MetaboScape® v6.0.2.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila separaci většiny analyzovaných žlučových kyselin i izobarických párů díky synergii LC a iontové mobility (TIMS). Pro 32 standardních kyselin byly stanoveny experimentální m/z, retenční časy a CCS hodnoty s RSD <0,3 %. Při aplikaci na biologické vzorky bylo v aquefikovaném a lyofilizovaném materiálu detekováno 12 až 14 kyselin, v séru 7 kyselin. Srovnání CCS hodnot s databází DTCCS Compendium i měřeními v nezávislých laboratořích prokázalo shodu v rámci ±1,7 % a reprodukovatelnost mezi pracovišti.

Přínosy a praktické využití metody

Nově vyvinutá UHPLC-TIMS-HRMS metoda zvyšuje jistotu anotace žlučových kyselin v komplexních matricích, poskytuje orthogonální rozlišení izomerů a umožňuje robustní mezi-laboratorní srovnání. Metoda je vhodná pro metabolomické studie, klinickou diagnostiku i farmakokinetické profily žlučových kyselin.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s kvantifikací pomocí internal standardů pro absolutní koncentrace.
• Rozšíření knihovny CCS hodnot o další metabolity a steroidy.
• Automatizace zpracování dat v softwarových platformách s podporou umělé inteligence.
• Využití TIMS-HRMS v klinických studiích pro monitoring terapie onemocnění trávicího traktu.

Závěr

Prezentovaná metoda UHPLC-TIMS-HRMS pro analýzu žlučových kyselin ve stolici a séru přináší vyšší specifičnost, reprodukovatelnost a možnost mezi-laboratorního srovnání. Tím se otevírá nový prostor pro spolehlivé profilování těchto biomarkerů v různých oblastech biomedicínského výzkumu.

Reference

1. 10.1007/s00216-019-01869-0
2. 10.1021/jasms.0c00015
3. 10.1194/jlr.R001941-JLR200
4. 10.1021/acs.analchem.5b01556
5. 10.1039/c8sc04396e