Development of a Rapid 2-AB Sample Preparation Workflow for N-Glycan Release and Labeling

Význam tématu

Charakterizace N-glykanů je klíčová pro vývoj bioterapeutik a ovlivňuje imunogenicitu, farmakokinetiku a farmakodynamiku proteinových léčiv. Přesné určení glykanačního profilu zajišťuje konzistenci a kvalitu konečného přípravku.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout rychlý workflow pro uvolnění N-glykanů a jejich značení 2-aminobenzamidem na pevné fázi bez nutnosti sušení a s časem přípravy kolem 2 hodin. Studie porovnává dva Agilent postupy: GlykoPrep Rapid N-Glycan Prep s 2-AB a AdvanceBio Gly-X N-Glycan Prep s 2-AB Express na vzorcích MabThera, Enbrel a NISTmAb.

Použitá metodika a instrumentace

Uvolnění N-glykanů probíhalo enzymem PNGase F v roztoku během 5 až 60 minut dle postupu. Značení 2-AB proběhlo přímo na matrici, nadbytek barviva se odstranil acetonitrilem a eluace vyznačených glykanů vodou bez sušení. Analýza se prováděla pomocí HILIC-UHPLC-FLR na amide kolóně (2,1×150 mm, 1,7 μm) při gradientu 25–38 % 50 mM ammonium formiátu pH 4,4, 0,4 mL/min a detekci FLR Ex/Em 360/428 nm. Doplněně UHPLC-MS pro hmotnostní určení.

Hlavní výsledky a diskuse

Oba postupy prokázaly srovnatelné glyko profily u všech tří molekul s podobnými relativními procentními obsahy a reprodukovatelným výkonem. AdvanceBio Gly-X s 2-AB Express zkracuje celkový čas přípravy na přibližně 2 hodiny oproti ~3,5 hodinám u GlykoPrep. U MabThera a Enbrel byl zaznamenán vyšší fluorescence signál u Gly-X, u NISTmAb byl signál srovnatelný. Profil glykosylačního vzorce odpovídal literatuře: G0F, G1F, G2F u MabThera a NISTmAb; u Enbrel byla vyšší sialylace a afukózace.

Přínosy a praktické využití metody

Workflow nabízí rychlou, automatizovatelnou a citlivou přípravu N-glykanů s minimální pracností a bez sušení. Metoda je vhodná pro QA/QC v bioprodukci, výzkum glykomiky a rutinní kontrolu glykozylace bioterapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další miniaturizace a plná robotická automatizace, integrace s MS pro online profiling, vývoj nových derivatizačních činidel s vyšší citlivostí a multiplexní glykanální analýzy. Metoda má potenciál pro high-throughput screening a průmyslovou QC.

Závěr

AdvanceBio Gly-X s 2-AB Express významně zkracuje dobu přípravy N-glykanů při zachování kvality dat a reprodukovatelnosti. Srovnatelné výsledky s tradičním GlykoPrep potvrdily vhodnost pro rutinní analýzu glykozylace v bioterapeutickém průmyslu.

Reference

• Liu L. Antibody glycosylation and its impact on the pharmacokinetics and pharmacodynamics of monoclonal antibodies and Fc-fusion proteins. J Pharm Sci. 2015;104(6):1866–1884.
• Ruhaak R. et al. Glycan labeling strategies and their use in identification and quantification. Anal Bioanal Chem. 2010;397(8):3457–3481.
• Aich U. et al. State-of-the-art technologies for rapid and high-throughput sample preparation and analysis of N-glycans from antibodies. Electrophoresis. 2016;37(11):1468–1488.
• Kimzey M. et al. Development of an instant glycan labeling dye for high throughput analysis by mass spectrometry. Agilent ASMS Poster. 2015.
• Yan J. et al. Comparison of common fluorescent labels for liquid chromatography analysis of released N-linked glycans. Agilent ASMS Poster. 2017.
• De Leoz M.L.A. et al. NIST IR 8186: NIST Interlaboratory Study on the Glycosylation of NISTmAb. 2017.
• Hilliard M. et al. Glycan characterization of the NIST RM monoclonal antibody using a total analytical solution. mAbs. 2017.