Quantification and structural characterization of glycans and glycopeptides by TQMS: the energy-resolved oxonium ion monitoring (Erexim) platform

Význam tématu

Glykanová analýza hraje klíčovou roli v biomedicíně, potravinářství a biotechnologiích pro charakterizaci glykoproteinů a jejich funkcí. Přesná kvantifikace a rozlišení strukturních izomerů glykosylovaných biomolekul je zásadní pro kontrolu kvality bioterapeutik, studium biologických procesů a vývoj nových diagnostických metod.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentovaného přístupu Erexim je sjednotit kvantitativní a strukturní analýzu glykanů a glykpeptidů na bázi triple kvadrupolového hmotnostního spektrometru (TQMS). Studie předkládá softwarové a instrumentální řešení, které kombinuje monitorování oxoniových iontů při různých energiích kolizí (CID) a vzájemné porovnání profilů, což umožňuje odlišit izobarické struktury i provést citlivou kvantifikaci.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda vychází z následujících kroků:

• Derivatizace N-glykanů 2-aminopyridinem (PA) a příprava glykpeptidů z lidského IgG tryptickou digesí a SPE frakcionací.
• Separace na kolónách reverse-phase HPLC (Aeris Peptide 1.7 μ 150×2.1 mm), mobilní fáze 0,1 % kyseliny mravenčí ve vodě (A) a acetonitrilu (B), program gradientu 2–98 % B.
• Detekce na Shimadzu LCMS-8050: ultrarychlé skenování (30 000 u/s), polarity switching 5 ms, až 555 MRM přechodů/s.
• Erexim profil: série MRM přechodů sledovaných při různých hodnotách CE pro m/z 138 a další klíčové oxoniové ionty.

Hlavní výsledky a diskuse

Citlivost a linearita:

• Kvantifikace glykpeptidů z IgG pro rozsah 2–1000 ng vstupního proteinu ukázala vynikající linearitu (r2 = 0,9998) a reprodukovatelnost.
• Relativní složení glykosylovaných forem bylo při 2 ng vzorku stanovitelné s CV do 4,5 %, u 1000 ng pod 0,5 %.

Strukturální elucidace:

• Erexim profily dvou izobarických PA-glykanů se terminální kyselinou sialovou na větvích α1-6 vs. α1-3 prokázaly odlišné dráhy fragmentace oxoniových iontů (např. m/z 366, 657), což koresponduje s teoretickou labilitou vazeb.

Přínosy a praktické využití metody

• Integrované řešení pro kvantifikaci i strukturní diferenciaci glykanů a glykopeptidů bez nutnosti vysoce rozlišovacího analyzátoru.
• Rychlá analýza desítek glykanových forem s vysokou citlivostí a opakovatelností, vhodné pro high-throughput screening a QA/QC procesy.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření databáze Erexim profilů na stovky glykanových standardů pro automatizovanou identifikaci neznámých vzorků.
• Integrace s online separačními technikami (UHPLC, capLC) a vyhodnocovacími AI algoritmy pro zrychlení datové analýzy.
• Potenciální aplikace v glyko-proteomice, vývoji bioterapeutik a monitoringu posttranslačních modifikací v klinických studiích.

Závěr

Erexim platforma představuje univerzální nástroj pro přesnou kvantifikaci a detailní strukturální charakterizaci glykanů a glykopeptidů na běžně dostupném TQMS. Kombinace energie-resolvované fragmentace a MRM přechodů umožňuje rozlišení izobarů i v komplexních matricích s výbornou citlivostí a reprodukovatelností. Další rozvoj databází a softwaru podpoří širší využití v biomedicíně, farmaceutickém výzkumu i průmyslové analytice.

Reference

• Toyama A. a kol. Quantification and structural characterization of glycans and glycopeptides by TQMS: the energy-resolved oxonium ion monitoring (Erexim) platform. ASMS 2015, MP686.
• Shimadzu Corporation. LCMS-8050 Technical Overview. First Edition, June 2015.