A Direct LC/MS/MS Method for Quantitative Determination of 25-Hydroxyvitamin D2 and D3 in Human Plasma

Význam tématu

Vitamin D je klíčový pro lidské zdraví a jeho postižení v těle se odráží v koncentracích metabolitů 25-hydroxyvitaminu D2 a D3 v plazmě. Přesné stanovení těchto látek je zásadní pro screening deficience vitaminu D, která může vést k chronickým onemocněním.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout přímou, citlivou a rychlou LC/MS/MS metodu s APCI pro kvantifikaci 25-OH-VD2 a 25-OH-VD3 v lidské plazmě bez náročné extrakce nebo derivatizace. Metoda umožnila rozsah stanovení 1 až 100 ng/mL s dolní mezí kvantifikace 3 ng/mL při objemu injekce 10 µL.

Použitá metodika a instrumentace

Využit byl systém Shimadzu LCMS-8050 s APCI v pozitivním módu a kolona Kinetex 1.7 µm C18 (100×2.1 mm). Mobilní fáze obsahovala 0.1% formic acid ve vodě a methanolu při průtoku 0.5 mL/min podle gradientního programu (15 minut) při 45 °C. Jako interní standardy sloužily deuterované 25-OH-VD2-d6 a 25-OH-VD3-d6. Příprava vzorku spočívala v precipitaci proteinů acetonitrilem/methanolem (1:1), centrifugaci, filtraci a přímé injekci.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace MRM vybrala tři přechody pro každý analyzát. Kalibrační křivky v plazmě vykázaly lineární odezvu s R2 >0.996. Matricové efekty, účinnost zotavení a celková procesní účinnost byly v rozsahu ±15% s výjimkou jedné hodnoty. Opakovatelnost (%RSD) zůstala pod 7,5 % pro střední hladiny, u nejnižších koncentrací se pohybovala mezi 7 a 22 %. Reziduum 25-OH-VD3 v blank plazmě vyžadovalo korekci interceptu kalibrace. LOD/LOQ odhadnuto na 1/3 ng/mL.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí rychlou analýzu bez časově náročné extrakce, nízké objemy vzorku (125 µL plazmy) a vysokou citlivost a specifičnost. Je vhodná pro klinické laboratoře, skríning vitaminu D a QA/QC v biomedicínském výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj může zahrnovat automatizaci přípravy vzorků, multiplexní stanovení dalších metabolitů vitaminu D, miniaturizaci metod a standardizaci mezilaboratorních kalibrací. Vhodné je také rozšíření do populačních studií a validace v rutinních diagnostických protokolech.

Závěr

Vyvinutá přímá LC/MS/MS metoda s APCI poskytuje citlivé, přesné a reprodukovatelné stanovení 25-hydroxyvitaminu D2 a D3 v lidské plazmě s minimem přípravných kroků.

Reference

• Shujing Ding et al., Anal Bioanal Chem. 2010;398(2):779–789
• Kazutake Shimada et al., J Chromatogr A. 2001;935:141–172
• Jiri Admec et al., J Sep Sci. 2011;34(1):11–20