Sensitive and Robust Measurement of Vitamin D Hydroxy Metabolites and Epimers in Serum Using the Agilent Ultivo Triple Quadrupole LC/MS

Význam tématu

Správné stanovení metabolitů vitamínu D a jejich epimerů v séru je klíčové pro hodnocení vitamínového stavu pacientů a diagnostiku řady onemocnění. Rozlišení izobarických forem 25(OH)D2, 25(OH)D3 a jejich epimerů eliminuje riziko nadhodnocení výsledků a zajišťuje vysokou analytickou specifitu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo vyvinout rychlou, citlivou a robustní LC–MS/MS metodu pro simultánní kvantifikaci čtyř cílových sloučenin: 25(OH)D2, 25(OH)D2-epi, 25(OH)D3 a 25(OH)D3-epi. Metoda využívá Agilent Ultivo triple quadrupole systém s kolonkou InfinityLab Poroshell 120 PFP a 10minutovým gradientem.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky séra byly zpracovány precipitací bílkovin studeným, kyselým acetonitrilem obsahujícím deuterované vnitřní standardy. Po centrifugaci se supernatanty analyzovaly LC–MS/MS v MRM režimu.

• LC: Agilent 1260 Infinity II se sorpční kolonkou Poroshell 120 PFP (3,0 × 100 mm, 2,7 μm), plynulý gradient 65–95 % methanolu s 0,1 % kyseliny formiové, 0,55 mL/min, doba analýzy 10 min.
• MS/MS: Agilent Ultivo LC/TQ (G6465B) s AJS ESI zdrojem, pozitivní ionizace, optimalizace tranzicí pomocí MassHunter Optimizer, MRM režim.
• Kalibrace: 1–200 ng/mL, koeficient korelace R² ≥ 0,999, limit kvantifikace 1 ng/mL pro 25(OH)D2 a 0,4 ng/mL pro 25(OH)D3 a epimery.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosahuje:

• Výborné chromatografické oddělení všech čtyř cílených sloučenin od epimerů během 10min gradientu.
• Precizitu s RSD <5 % pro plošný signál a <0,5 % pro retenční časy.
• Obnovení analytů 92–109 % s opakovatelností RSD ≤2 % (QC vzorky) a ≤4 % (referenční QC).
• Robustita potvrzena 500 kontinuálními injekcemi (RSD koncentrace <5 %, RSD RT <0,2 %).
• Minimální matrix efekt (>87 %) a zanedbatelné carry-over (<0,004 %).

Přínosy a praktické využití metody

Navržená metoda umožňuje spolehlivou a vysoce specifickou analýzu vitamínu D v klinických a výzkumných laboratořích. Díky krátkému analytickému času a vysoké robustnosti je vhodná pro rutinní testování velkého počtu vzorků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozšíření metody může zahrnovat multiparalelní detekci dalších vitamínových metabolitů, automatizaci přípravy vzorků a zavedení vysokopropustných platforem. Integrace pokročilých datových nástrojů a umělé inteligence může zvýšit rychlost zpracování a kvalitu interpretace výsledků.

Závěr

Vyvinutá LC–MS/MS metoda na systému Agilent Ultivo poskytuje citlivé, přesné a reprodukovatelné stanovení 25(OH)D2, 25(OH)D3 a jejich epimerů v séru. Rychlost analýzy a robustness umožňují implementaci do každodenní laboratorní praxe.

Reference

• Agilent Technologies. Application Note RA44538. 2021.