Improve Sensitivity for Quantification of Antisense Oligonucleotides in Plasma Using Microflow LC MRM Methodology

Význam tématu

Oligonukleotidové terapeutické látky se stávají klíčovou třídou nových léčiv díky své schopnosti cíleně ovlivňovat genovou expresi. V praxi je nezbytné spolehlivě a citlivě kvantifikovat tyto molekuly v biologických matricích, přičemž tradiční LC-MS přístupy často limituje nedostatečná citlivost. Zavedení mikroflow chromatografie otevírá cestu k dosažení úrovní detekce srovnatelných s hybridizačními ELISA, a to při zachování výhod hmotnostní spektrometrie.

Cíle a přehled studie / článku

Studie demonstruje použití systému QTRAP 6500+ LC-MS/MS spolu s OptiFlow rozhraním a M5 MicroLC systémem k měření antisenzačního oligonukleotidu fomivirsen v plazmě potkana. Hlavním cílem bylo porovnat citlivost klasické vysokoprůtočné chromatografie s mikroflow přístupem a vyhodnotit zlepšení signál-šum (S/N) a spodní hranice kvantifikace (LLOQ) v rozsahu 0,1–1000 ng/mL.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky byly připraveny extrakcí 100 µL plazmy přes OTX Clarity SPE postup se standardními iontově-vazebnými činidly HFIP a DIEA. Po elučním kroku se analyty vysušily a rekonstituovaly v mobilní fázi A (100 mM HFIP, 15 mM DIEA, 100 µM EDTA).

Pro komparativní analýzu byly použity dva chromatografické režimy:

• Vysokoprůtočný režim: ExionLC s IonDrive Turbo V zdrojem.
• Mikroflow režim: M5 MicroLC a OptiFlow Turbo V zdroj s průtokem až 1 µL/min.

Detekce probíhala metodou MRM na systému QTRAP 6500+ s optimalizovanými on-column parametry zdroje.

Hlavní výsledky a diskuse

Mikroflow chromatografie přinesla v průměru pětinásobné zlepšení S/N oproti vysokoprůtočnému režimu. Spodní kvantifikační mez se posunula na 0,1 ng/mL, přičemž linearita kalibrační křivky byla zachována v rozsahu 0,1–1000 ng/mL s přesností i opakovatelností (CV) pod 8 %. Obnova analyzovaného oligonukleotidu z plazmy dosáhla cca 80 % a přesnost měření se pohybovala kolem 95–105 %.

Přínosy a praktické využití metody

Implementovaný mikroflow LC-MS/MS protokol nabízí:

• Výrazné zvýšení citlivosti pro kvantifikaci oligonukleotidů v biologických matricích.
• Zachování robustnosti a reproducibility analýzy při nižší spotřebě rozpouštědel.
• Možnost rychlého přepínání mezi vysokoprůtočným a mikroflow režimem s minimální optimalizací.
• Alternativu k hybridizačním ELISA metodám s výhodami přesné hmotnostní analýzy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj lze očekávat v oblasti:

• Integrace mikroflow LC s vysoce rozlišovacími hmotnostními analyzátory pro simultánní vícekomponentní stanovení.
• Automatizace přípravy vzorků a nasazení v klinických farmakokinetických studiích.
• Rozšíření protokolů na nové chemické modifikace oligonukleotidů a jejich metabolity.
• Miniaturizace a digitální kontrola pro aplikace v diagnostice a personalizované medicíně.

Závěr

Microflow LC-MRM metodika na systému QTRAP 6500+ s OptiFlow a M5 MicroLC výrazně zvyšuje citlivost kvantifikace antisense oligonukleotidů v plazmě. Tato workflow kombinuje výhody hmotnostní spektrometrie s robustností a nízkými náklady na provoz, čímž představuje perspektivní nástroj pro bioanalytické a klinické aplikace.