Analytical-Scale LC Purification with High Load and Low Dispersion - The Agilent 1260 Infinity II Analytical-Scale LC Purification Systems

Význam tématu

Analytická purifikace na LC stupni umožňuje izolovat menší množství cílových molekul pomocí stávajícího analytického HPLC systému rozšířeného o sběrač frakcí. Tím odpadá potřeba samostatného preparativního přístroje, šetří se čas, prostor i náklady na školení.

Cíle a přehled studie

Studie demonstruje, jak přejít z analytického na malopreparativní režim na systému Agilent 1260 Infinity II LC se sběračem frakcí a OpenLab CDS 2.5. Porovnávají se tři C18 kolony (ZORBAX Eclipse Plus, Poroshell 120 EC-C18, Pursuit XRs) pro purifikaci modelových kyselin 3,5-dihydroxybenzoové a 4-hydroxybenzoové.

Použitá metodika a instrumentace

Instrumentace:

• Agilent 1260 Infinity II Quaternary Pump (G7111B)
• Vialsampler (G7129A)
• Diode Array Detector WR 10 mm (G7115A)
• Analytical-Scale Fraction Collector (G1364F)

Chromatografie:

• Mobilní fáze A: 0,1 % formic acid ve vodě, B: 0,1 % formic acid v acetonitrilu
• Gradient 10 → 30 % B v 3,5 min, 98 % B na 4 min, celkem 8 min
• Průtok 1,5 mL/min, objem injekce 0,5 µL pro kvantifikaci, 75–100 µL pro purifikaci
• Detekce UV při 254 nm, šířka píku > 0,05 min

Vzorky: DHBA a HBA v acetonitril/voda 20/80 a 50/50, koncentrace 62,5 µg/mL až 160 mg/mL.

Hlavní výsledky a diskuse

• Pursuit XRs vykázala nejvyšší retenční sílu, Poroshell 120 dosáhl nejlepšího rozlišení (vyšší EP díky nižší šířce píků), ZORBAX střední hodnoty.
• Linearity pro HBA na všech kolónách r > 0,999.
• Maximální zatížení bez ztráty baseliny: ZORBAX 75 µL, Poroshell 120 85 µL, Pursuit XRs 100 µL (40 mg/mL vzorek).
• Purifikace: čistota > 99 %, recovery 96–97 % (6 opakování).
• Izolace na Pursuit XRs: až 4 mg DHBA na běh, celkem >50 mg za čtyři frakce.

Přínosy a praktické využití metody

• Přepnutí mezi analytickým a malopreparativním režimem bez dalšího hardware či softwaru.
• Úspora místa i nákladů na údržbu a školení.
• Rychlý vývoj metod pro izolaci malých molekul pro biologické testy, NMR nebo další charakterizaci.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Nové kolony se zvýšenou kapacitou a menší disperzí pro ještě vyšší průtoky.
• Automatizace purifikační sekvence pomocí robotických systémů.
• Pokročilá software pro online vyhodnocení čistoty a optimalizaci sběru.
• Rozšíření aplikace na peptidy, oligonukleotidy či komplexní přírodní extrakty.

Závěr

Přidáním sběrače frakcí do analytického Agilent 1260 Infinity II LC systému a použitím kolony Pursuit XRs lze dosáhnout vysoké kapacity i čistoty (> 99 %) při návratnosti 96–97 %. Tento přístup umožňuje efektivní malopreparativní purifikaci bez nutnosti samostatných instrumentů.

Reference

• Florian Rieck. Analytical-scale LC Purification with High Load and Low Dispersion. Agilent Technologies, 2020.