Elevate Your mAb Aggregate Analysis - High-resolution SEC with the Agilent 1290 Infinity II Bio LC System

Význam tématu

Monitorování agregací u monoklonálních protilátek je klíčové pro zajištění bezpečnosti a účinnosti bioterapeutik. Technika SEC (Size Exclusion Chromatography) umožňuje spolehlivě stanovit molekulovou hmotnost, rozlišit monomery od nežádoucích agregátů a sledovat kritické atributy kvality (CQA) během vývoje i výroby farmaceutických bílkovin.

Cíle a přehled studie

Cílem application note bylo demonstrovat, jak Agilent 1290 Infinity II Bio LC vybavený kolonou AdvanceBio SEC a ultranízkodisperzními kapilárami zvyšuje rozlišení proteinové SEC analýzy. Studie porovnala účinek různých průměrů kapilár (0,07; 0,12; 0,17 mm) na separaci směsi kalibračních proteinů, monoklonální protilátky trastuzumab i standardizovaného NISTmAb, včetně agregátů vzniklých pH- a teplotním stresem.

Použitá metodika a instrumentace

Protokol využíval:

• Agilent 1290 Infinity II Bio LC System (pumpa, autosampler, termostat, detektor VWD)
• AdvanceBio SEC kolonu 200 Å, 4,6 × 300 mm, 1,9 µm
• Ultra Low Dispersion Kit s kapilárami průměru 0,07/0,12/0,17 mm
• Agilent OpenLab GPC/SEC software pro jednorozhraní výpočet distribuční křivky a molekulové hmotnosti

Standardní mobilní fáze: PBS pH 7,4, průtok 0,35 mL/min, teplota kolony 30 °C, objem injekce 5 µL, detekce při 280 nm.

Hlavní výsledky a diskuse

Kapiláry o průměru 0,07 mm prokázaly nejvyšší rozlišení separation kalibrační směsi a protilátek (rozlišení až 3,34 pro Herceptin a 3,11–3,33 pro NISTmAb). Větší průměry kapilár vedly k širším vrcholům a nižší rozlišovací schopnosti. Kalibrační křivka čtvrtého řádu umožnila přesné stanovení Mp pro monomer i dimer. Trastuzumab vykázal Mp 141 566 Da, dimer agregát 321 609 Da. Po pH/teplotním stresu byly detekovány dimer, trimer a vyšší agregáty, jejich separace byla možná jen při minimálních dead volume.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda zajišťuje rychlou a přesnou charakterizaci mAb agregátů v jediném softwarovém workflow bez nutnosti přepínání systémů. Biokompatibilní UHPLC platforma zvládá slané pufry s nízkými nároky na údržbu, což snižuje provozní náklady laboratoří v biopharma průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj lze očekávat v integraci hmotnostní detekce (LC-MS) pro detailnější charakterizaci, automatizaci high-throughput screeningových protokolů a využití umělé inteligence pro pokročilou analýzu dat. Miniaturizace separační cesty a mikrofluidní řešení pak umožní další zrychlení a snížení spotřeby vzorku.

Závěr

Agilent 1290 Infinity II Bio LC ve spojení s AdvanceBio SEC kolonnou a ultranízkodisperzními kapilárami výrazně zlepšuje rozlišení SEC analýzy mAb a jejich agregátů. Platforma nabízí vysokou reprodukovatelnost, nízké dead volume a spolehlivé stanovení molekulové hmotnosti v jediném software.

Reference

1. Quantitation of mAb and ADC Aggregation Using SEC and an Aqueous Mobile Phase. Agilent Technologies application note, publication number 5991-6303EN, 2016.