Complementary Methodologies for Analysis of NISTmAb Impurities

Význam tématu

Charakterizace velikostních nečistot monoklonálních protilátek (mAb) je klíčová pro zajištění jejich účinnosti a bezpečnosti v terapeutických aplikacích. Agregace a degradace mohou ovlivnit farmakokinetiku a imunitní odpověď, proto regulační orgány vyžadují detailní hodnocení těchto kritických parametrů.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo porovnat a zdůraznit komplementaritu dvou analytických metod – Size Exclusion Chromatography (SEC) a Capillary Electrophoresis–SDS (CE-SDS) – při hodnocení monomerické čistoty referenčního standardu NISTmAb. Studie demonstruje, jak každá technika přináší odlišné, ale doplňující informace o vysokomolekulárních (HMW) agregátech a nízkomolekulárních (LMW) fragmentech.

Použitá metodika a instrumentace

• SEC analýza za nativních podmínek na Agilent 1290 Infinity II Bio LC systému s AdvanceBio SEC 1.9 µm kolonu
• CE-SDS analýza na Agilent ProteoAnalyzer systému pomocí Protein Broad Range P240 kitu, za redukujících a neredukujících podmínek
• Mobilní fáze: 150 mM fosfátový pufr, pH 7.0, průtok 0,1 mL/min, teplota kolony 30 °C, detekce při 280 nm
• Příprava vzorků v PBS, konc. 2 mg/mL, značení dle protokolu, inkubace při 70 °C

Hlavní výsledky a diskuse

• SEC stanovila monomerickou čistotu 97,83 % (referenční hodnota 96,63 %), HMW agregáty 2,05 % a LMW fragmenty 0,12 %
• CE-SDS detekovala monomer 98,18 % (referenční hodnota 98,47 %) a detailně rozlišila LMW komponenty (LC, HC, Fab, HC:LC, HC:HC, HC:HC:LC) tvořící dohromady 1,82 %
• Mezi SEC a CE-SDS byl rozdíl v určení LMW nečistot až 1,7 %, což odráží selektivní popis nekovalentních interakcí

Přínosy a praktické využití metody

• SEC rychle a spolehlivě kvantifikuje agregáty za nativních podmínek
• CE-SDS umožňuje vysoké rozlišení a kvantifikaci jednotlivých fragmen­tů
• Kombinace obou přístupů poskytuje komplexní profil velikostní heterogenity mAb

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace ultrarychlých SEC a multi­kapilární CE pro zvýšení propustnosti
• Vývoj digitální analýzy dat a strojového učení pro automatizované hodnocení heterogenity
• Rozšíření metod na biomolekuly s pokročilými modifikacemi (glykozylace, pegylace)

Závěr

Porovnání SEC a CE-SDS prokázalo jejich vzájemnou doplňkovost při hodnocení velikostní čistoty mAb. SEC lépe měří agregáty, zatímco CE-SDS odhaluje detaily LMW fragmentů. Společné využití obou technik zajišťuje komplexní kontrolu kvality terapeutických protilátek.

Reference

1. Turner A. a kol. Anal. Bioanal. Chem. 2018, 410(8), 2095–2110.
2. USP General Chapter 129, Analytical Procedures for Recombinant Therapeutic Monoclonal Antibodies, USP-NF 2024.
3. Michels D.; Parker M.; Salas-Solano O. Electrophoresis 2012, 33, 815–826.
4. Agilent Technologies. Elevate Your mAb Aggregate Analysis. Application Note 5994-2709EN, 2020.
5. NIST Reference Material 8671: NISTmAb, Humanized IgG1κ Monoclonal Antibody, Lot 14HB-D-002.