High-Throughput In Vitro ADME Analysis with Agilent RapidFire/MS Systems: Cytochrome P450 Inhibition
Aplikace | 2020 | Agilent TechnologiesInstrumentace
Analýza inhibice cytochromu P450 je klíčová pro hodnocení možných interakcí mezi léčivy a predikci nežádoucích účinků v raných fázích vývoje. Díky přesunu in vitro ADME testování do dřívějších stadií roste potřeba metod umožňujících rychlou a nákladově efektivní analýzu velkého objemu vzorků.
Cílem bylo porovnat výkon systému Agilent RapidFire/MS s tradičními LC/MS/MS metodami při měření IC50 hodnot inhibice různých CYP izoenzymů v přímých i časově závislých experimentech na lidských jaterních mikrozomech.
Systém Agilent RapidFire/MS ve spojení s triple kvadrupólovým (QQQ) nebo TOF hmotnostním spektrometrem. Pro referenční měření byly použity konvenční LC/MS/MS přístroje.
Experimenty probíhaly s FDA doporučenými substráty a standardními sedmibodovými koncentracemi inhibitorů. Pro přímé měření IC50 se prováděly jednorázové inkubace lidských jaterních mikrozomů se stabilně značenými vnitřními standardy. U časově závislé inhibice byly vzorky předinkubovány s NADPH a následně testovány stejným způsobem.
Srovnání RapidFire/MS a tradiční LC/MS/MS pro osm různých enzym-substrátových párů prokázalo velmi dobrou korelaci (R2=0,986). RapidFire/MS skracuje dobu analýzy na 6–10 s na vzorek oproti 2–4 minutám při LC/MS/MS, což znamená více než desetinásobné zvýšení propustnosti. V časově závislých studiích bylo dosaženo až 20násobného zrychlení analýzy.
RapidFire/MS umožňuje snadnou integraci do existujících laboratorních workflow a nabízí robustní alternativu pro vysokopropustné ADME screeningy. Metoda poskytuje spolehlivá data o inhibici CYP izoenzymů s výrazným časovým i ekonomickým přínosem.
Očekává se další rozvoj vysokopropustných hmotnostních technik spojených s plnou automatizací inkubace a vzorkového podávání. Rozšíření aplikace na další metabolické dráhy a integrace s pokročilými datovými analýzami zvýší efektivitu preklinického výzkumu.
Systém Agilent RapidFire/MS prokázal vysokou přesnost a významné časové úspory při hodnocení inhibice cytochromů P450 a představuje robustní alternativu k tradičním LC/MS/MS metodám.
Příprava vzorků, LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
ZaměřeníKlinická analýza
VýrobceAgilent Technologies
Souhrn
Význam tématu
Analýza inhibice cytochromu P450 je klíčová pro hodnocení možných interakcí mezi léčivy a predikci nežádoucích účinků v raných fázích vývoje. Díky přesunu in vitro ADME testování do dřívějších stadií roste potřeba metod umožňujících rychlou a nákladově efektivní analýzu velkého objemu vzorků.
Cíle a přehled studie
Cílem bylo porovnat výkon systému Agilent RapidFire/MS s tradičními LC/MS/MS metodami při měření IC50 hodnot inhibice různých CYP izoenzymů v přímých i časově závislých experimentech na lidských jaterních mikrozomech.
Použitá instrumentace
Systém Agilent RapidFire/MS ve spojení s triple kvadrupólovým (QQQ) nebo TOF hmotnostním spektrometrem. Pro referenční měření byly použity konvenční LC/MS/MS přístroje.
Použitá metodika
Experimenty probíhaly s FDA doporučenými substráty a standardními sedmibodovými koncentracemi inhibitorů. Pro přímé měření IC50 se prováděly jednorázové inkubace lidských jaterních mikrozomů se stabilně značenými vnitřními standardy. U časově závislé inhibice byly vzorky předinkubovány s NADPH a následně testovány stejným způsobem.
Hlavní výsledky a diskuse
Srovnání RapidFire/MS a tradiční LC/MS/MS pro osm různých enzym-substrátových párů prokázalo velmi dobrou korelaci (R2=0,986). RapidFire/MS skracuje dobu analýzy na 6–10 s na vzorek oproti 2–4 minutám při LC/MS/MS, což znamená více než desetinásobné zvýšení propustnosti. V časově závislých studiích bylo dosaženo až 20násobného zrychlení analýzy.
Přínosy a praktické využití metody
RapidFire/MS umožňuje snadnou integraci do existujících laboratorních workflow a nabízí robustní alternativu pro vysokopropustné ADME screeningy. Metoda poskytuje spolehlivá data o inhibici CYP izoenzymů s výrazným časovým i ekonomickým přínosem.
Budoucí trendy a možnosti využití
Očekává se další rozvoj vysokopropustných hmotnostních technik spojených s plnou automatizací inkubace a vzorkového podávání. Rozšíření aplikace na další metabolické dráhy a integrace s pokročilými datovými analýzami zvýší efektivitu preklinického výzkumu.
Závěr
Systém Agilent RapidFire/MS prokázal vysokou přesnost a významné časové úspory při hodnocení inhibice cytochromů P450 a představuje robustní alternativu k tradičním LC/MS/MS metodám.
Reference
- Perloff E., et al. Validation of cytochrome P450 time-dependent inhibition assays: a two-time point IC50 shift approach facilitates kinact assay design. Xenobiotica, 2011, 39(2):99-112.
- Perloff E., et al. Comparison of RapidFire Ultra High Throughput LC/MS/MS with Traditional LC/MS/MS for Cytochrome P450 Inhibition Testing. Abstract #106, 11th European ISSX Meeting, 2009.
- Miller V., et al. Evaluation of High Throughput Screening Methods for Time-Dependent Inhibition of CYP3A4 Utilizing RapidFire LC/MS/MS Technology. 11th European ISSX Meeting, 2009.
Obsah byl automaticky vytvořen z originálního PDF dokumentu pomocí AI a může obsahovat nepřesnosti.
Podobná PDF
High-Throughput In Vitro ADME Analysis with Agilent RapidFire/MS Systems: Cytochrome P450 Inhibition
2020|Agilent Technologies|Aplikace
High-Throughput In Vitro ADME Analysis with Agilent RapidFire/MS Systems: Cytochrome P450 Inhibition Application Note Authors Vaughn Miller Agilent Technologies, Inc. Wakefield, MA, USA Introduction Analysis of cytochrome P450 (CYP) inhibition is an important component of the drug discovery process as…
Klíčová slova
rapidfire, rapidfirenadph, nadphinhibitor, inhibitornaph, naphmidazolam, midazolamremaining, remainingactivity, activityinhibition, inhibitioncyp, cypazamulin, azamulindrug, drugcytochrome, cytochromeritonavir, ritonavirwithout, withoutthroughput
High-Throughput Analysis of Cytochrome P450 Inhibition in Intact Human Hepatocytes
2014|Agilent Technologies|Aplikace
High-Throughput Analysis of Cytochrome P450 Inhibition in Intact Human Hepatocytes Application Note Authors Abstract Kari E. Schlicht and Vaughn P. Miller Ultrafast methods of analysis were developed using the Agilent RapidFire Agilent Technologies, Inc. High‑Throughput Mass Spectrometry System in combination…
Klíčová slova
hepatocytes, hepatocytesinhibition, inhibitionsip, sipcyp, cyprapidfire, rapidfireactivity, activitysensor, sensorvitro, vitrolog, loghlms, hlmshydralazine, hydralazinenaphthoflavone, naphthoflavonedesethylamodiaquine, desethylamodiaquinecryopreserved, cryopreservedthroughput
Development of Label-Free, Enzymatic CYP17A1 Assays Using the Agilent 6150 Single Quadrupole LC/MS System
2011|Agilent Technologies|Aplikace
Development of Label-Free, Enzymatic CYP17A1 Assays Using the Agilent 6150 Single Quadrupole LC/MS System Application Note Authors Abstract Robert Wurm and Kenneth Lewis OpAns, LLC Durham, NC USA This application note describes the development of fast, label-free in vitro enzymatic…
Klíčová slova
substrate, substratecounts, countsfinal, finalproduct, productdepletion, depletioninhibitor, inhibitorhydroxylase, hydroxylasemin, minreaction, reactiontime, timemetconazole, metconazoleassay, assaytesticular, testicularconcentration, concentrationmixture
Fragment-Based Drug Discovery: Comparing Labeled and Label-Free Screening of β-Amyloid Secretase (BACE-1) Using Fluorescence Spectroscopy and Ultrafast SPE/MS/MS
2013|Agilent Technologies|Aplikace
Fragment-Based Drug Discovery: Comparing Labeled and Label-Free Screening of β-Amyloid Secretase (BACE-1) Using Fluorescence Spectroscopy and Ultrafast SPE/MS/MS Application Note Authors Introduction Lauren E. Frick and William A. LaMarr Agilent Technologies, Inc. Wakefield, MA, USA Fragment-based screening offers advantages over…
Klíčová slova
unlabeled, unlabeledlfs, lfssubstrate, substratehits, hitslabeled, labeledums, umslms, lmsrapidfire, rapidfirewere, werepeptide, peptideassays, assaysfluorescently, fluorescentlyhit, hitautofluorescence, autofluorescenceinhibition
