Development of Label-Free, Enzymatic CYP17A1 Assays Using the Agilent 6150 Single Quadrupole LC/MS System

Význam tématu

Enzym CYP17A1 představuje klíčový biokatalyzátor v biosyntéze steroidních hormonů v lidském těle. Jeho dvě funkce – 17α-hydroxylace pregnenolonu/progesteronu a následné C17–C20 štěpení 17α-hydroxy derivátů – ovlivňují tvorbu hormonů, jako je dehydroepiandrosteron a androstenedion. Dysfunkce CYP17A1 se váže k onemocněním, jako jsou polycystický ovariální syndrom, Cushingův syndrom, kongenitální adrenální hyperplazie či rakovina prostaty. Vývoj rychlých, citlivých a vysoce výtěžných in vitro testů pro stanovení aktivity tohoto enzymu je proto zásadní pro screening nových inhibitorů v rané fázi vývoje léčiv.

Cíle a přehled studie / článku

Autoři popisují přípravu dvou značením nevázaných enzymatických testů pro měření 17α-hydroxylázy a C17,20-lyázy (lyázy) CYP17A1 v 96-jamkovém formátu. Cílem bylo udržet fyziologicky relevantní podmínky, zajistit rychlou analýzu (<1 minuty per injekce) a dosáhnout vysoké citlivosti pomocí kombinace ultrarychlého kapalného chromatografu s jednodeskovým hmotovým spektrometrem (LC/MS).

Použitá metodika a instrumentace

Enzymatické reakce byly prováděny v 96-jamkové destičce při 37 °C. Zdroj enzymu tvořily potkaní varlečné mikrozomy (100 μg/mL pro hydroxylázu, 250 μg/mL pro lyázu). Substráty (progesteron a 17α-hydroxyprogesteron) byly použity v konečné koncentraci 1 μM. Reakce se spouštěla přidáním regenerace NADPH a po 10 minutách zastavila acetonitrilem. Princip měření spočíval v porovnání ploch produktů s aktivním standardem bez inhibitoru. Separace a detekce probíhaly na Agilent 1290 Infinity LC systému se sloupcem Zorbax Poroshell 120 EC C18 (2,1 × 30 mm, 55 °C) a Agilent 6150 Single Quadrupole LC/MS se zdrojem Jet Stream ESI v pozitivním módu. Optimální gradienty a detekční ionty (M+H, M+Na) byly stanoveny pro oba testy.

Hlavní výsledky a diskuse

Oba assay prokázaly jasné oddělení špiček substrátu i produktu během méně než 0,7 minuty. U hydroxylázového testu byla dosažena injekce-injekce time-to-time ~0,9 minuty, u lyázového ~0,8 minuty. Použití modelového inhibitora metkonazolu vedlo ke stanovení IC50: 8,8 μM (produkční křivka) a 8,4 μM (substrátová křivka) pro hydroxylázu, a 2,9 μM pro lyázu. Zachycené chromatogramy potvrdily lineární odezvu signálu v rozsahu 0,32–40 μM inhibitoru a umožnily sledovat paralelní pokles substrátu a nárůst produktu.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká výtěžnost a citlivost detekce LC/MS bez nutnosti značení substrátů.
• Rychlý režim analýzy vhodný pro vysoko propustné screeningové procesy.
• Fyzikálně-chemické podmínky odpovídají fyziologii, což zvyšuje relevanci získaných IC50 hodnot.
• Flexibilita – lze využít pro testování dalších P450 isoenzymů či širší sadu substrátů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další zkracování doby analýzy díky pokročilým ultračistým sloupcům a rychlejším gradientům.
• Integrace s automatizovanými robotickými platformami pro vyšší propustnost.
• Využití vysokorozlišovací MS k odhalení vedlejších metabolit a zlepšení selektivity.
• Rozšíření panelu testů o multiplexní měření více enzymových aktivit v jedné injekci.

Závěr

Vyvinuté bezznačkové in vitro assay pro CYP17A1 efektivně měří hydroxylázovou i lyázovou aktivitu pod fyziologickými podmínkami s vysokou citlivostí a rychlostí. Kombinace Agilent 1290 Infinity LC a 6150 Single Quadrupole MS poskytuje robustní nástroj pro screening nových inhibitorů v raných fázích vývoje léků.

Reference

1. Lieberman S., Warne P.A. 17-Hydroxylase: an evaluation of the present view of its catalytic role in steroidogenesis. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 2001, 78:299–312.
2. Lunn R.M. et al. Prostate cancer risk and polymorphism in 17 hydroxylase (CYP17) and steroid reductase (SRD5A2). Carcinogenesis, 1999, 20:1727–1731.
3. Madigan M.P. et al. CYP17 polymorphisms in relation to risks of prostate cancer and benign prostatic hyperplasia: a population-based study in China. International Journal of Cancer, 2003, 107:271–275.
4. Maitra A., Shirwalkar H. Congenital adrenal hyperplasia: biochemical and molecular perspectives. Indian Journal of Experimental Biology, 2003, 41:701–709.
5. Miller W.L. Androgen biosynthesis from cholesterol to DHEA. Molecular and Cellular Endocrinology, 2002, 198:7–14.
6. Ogo A. et al. Markedly increased expression of cytochrome P-450 17-hydroxylase (P-450c17) mRNA in adrenocortical adenomas from patients with Cushing’s syndrome. Molecular and Cellular Endocrinology, 1991, 80:83–89.
7. Qin K.N., Rosenfield R.L. Role of cytochrome P450c17 in polycystic ovary syndrome. Molecular and Cellular Endocrinology, 1998, 145:111–121.
8. Strauss J.F. III. Some new thoughts on the pathophysiology and genetics of polycystic ovary syndrome. Annals of the New York Academy of Sciences, 2003, 997:42–48.