High-Throughput Analysis of Cytochrome P450 Inhibition in Intact Human Hepatocytes

Význam tématu

In vitro hodnocení inhibice cytochromu P450 je klíčové pro předpověď možných lékových interakcí a bezpečnosti léčiv. Použití lidských hepatocytů nabízí fyziologické podmínky včetně membránových transportérů a kompletní sady enzymů a kofaktorů, což zvyšuje relevanci výsledků pro predikci in vivo.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a aplikovat ultrarychlou metodu pro stanovení inhibice šesti hlavních P450 izoenzymů (CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2D6, CYP3A4) v intactních lidských hepatocytech. Hodnocení proběhlo pomocí šesti specifických substrátů a patnácti modelových inhibitorů v sedmi koncentracích za účelem stanovení IC50 hodnot s vysokým průtokem vzorků.

Použitá metodika a instrumentace

• Agilent RapidFire 365: automatizované odběry vzorků v 384-jamkových destičkách s intervalem analýzy ≤ 13 s na vzorek
• Agilent 6490 Triple Quadrupole Mass Spectrometer s MassHunter Qualitative a Quantitative Analysis Software B.05.00
• Cryoprezervované lidské hepatocyty (In Vitro ADMET Laboratories) z pěti mužských a pěti ženských dárců, poolované před použitím
• Substráty: tacrin (5 µM), bupropion (400 µM), amodiachin (7,5 µM), diklofenak (25 µM), dextromethorfan (25 µM) a midazolam (15 µM)
• Inhibitory v sedmi koncentracích (0–200 µM), inkubace 60 min, zastavení reakcí acetonitrilem s vnitřními standardy
• MRM parametry optimalizovány pro jednotlivé metabolity (tranzice Q1/Q3, CE, CAV)

Hlavní výsledky a diskuse

Ultrafast platforma umožnila analýzu více než 275 vzorků za hodinu. Byla potvrzena izoformně selektivní a dávkově závislá inhibice všech testovaných CYP izoenzymů. Výjimku představovalo nedostatečné potlačení CYP2C8 gemfibrozilem a CYP2C9/CYP2D6 1-aminobenzotriazolem, pravděpodobně vyžadující delší preinkubaci pro aktivní metabolity. IC50 hodnoty (např. ketokonazol pro CYP3A4 < 0,27 µM) odpovídaly literatuře a demonstrovaly vysokou citlivost metody.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zvýšení throughput pro ADME screening
• Relevance intactních hepatocytů pro predikci in vivo
• Možnost rychlého profilování selektivních inhibitorů napříč více izoenzymy
• Snížení doby analýzy oproti konvenčním LC/MS/MS metodám

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace automatizace a miniaturizace pro další zvýšení kapacity
• Adaptace preinkubačních protokolů pro induktory a aktivní metabolity
• Rozšíření na multiplexní ADME assay, včetně metabolické stability a transportérů
• Využití strojového učení pro analýzu dat a predikci interakcí

Závěr

Studie prokázala, že kombinace Agilent RapidFire 365 a 6490 Triple Quadrupole MS nabízí ultrarychlou a spolehlivou platformu pro hodnocení inhibice klíčových CYP450 izoenzymů v intactních lidských hepatocytech. Metoda přináší vysokou propustnost, biologickou relevanci a potenciál pro rozšířené in vitro ADME aplikace.

Reference

• Miller V. High-Throughput In Vitro ADME Analysis with Agilent RapidFire/MS Systems: Cytochrome P450 Inhibition. Agilent Technologies Application Note 5990-9184EN, 2011.
• Danker K., Schlicht K. E. Optimization of Ultrafast CYP3A4 Inhibition and Multiplexed CYP Inhibition Assays Using the RapidFire High-Throughput Mass Spectrometry System. Agilent Technologies Application Note 5991-3693EN, 2013.
• Miller V. SPE-MS analysis of absorption, distribution, metabolism and excretion assays: a tool to increase throughput and streamline workflow. Bioanalysis 2012, 4(9):1111–1121.
• Li A. P. Human hepatocytes: isolation, cryopreservation and applications in drug development. Chem. Biol. Interact. 2007, 168(1):16–29.