Highly sensitive quantitative analysis of Leuprolide from rat plasma using LC-MS/MS

Význam tématu

Analýza xenobiotik v biologických matricích je zásadní pro vývoj nových léčiv a charakterizaci farmakokinetiky. Kvantifikace kandidátní látky v plazmě při nízkých koncentracích poskytuje data pro optimalizaci dávek a režimů podání. Leuprolid, endogenní analog GnRH, je terapeuticky využíván při léčbě rakoviny prostaty, endometriózy a myomů dělohy, přičemž nízká biologická dostupnost vyžaduje mimořádně citlivé metody stanovení.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a validovat vysoce citlivou metodiku LC-MS/MS pro kvantitativní analýzu Leuprolidu v potkaní plazmě v rozsahu 10 pg/mL až 300 000 pg/mL. Hodnoceny byly parametry jako linearita, specificita, přesnost, opakovatelnost, mezní kvantifikovatelná koncentrace (LLOQ), výtěžnost extrakce a matrice efekt.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky plazmy byly připraveny pomocí SPE (solid phase extraction):

• Podmínění kolonek 1 mL metanolu a 1 mL vody
• Naložení vzorku (plná objemová dávka plazmy)
• Proplach 1 mL vody a 1 mL 20% acetonitrilu
• Eluce 1 mL metanolu

Eluát byl vysušen při 50 °C a rehydratován v 100 µL roztoku pro HPLC.
Instrumentace:

• UHPLC Nexera X2 se sloupcem Shim-pack C18 (100 × 2,1 mm, 2,7 µm), gradientní eluce při 0,5 mL/min, teplota 40 °C
• MS detekce na Shimadzu LCMS-8060, triple kvadrupól, ESI s vyhřívanou kapilárou (heated ESI probe)
• MRM přechody: Leuprolid m/z 605 > 249, interní standard Goserelin m/z 635 > 221

Hlavní výsledky a diskuse

Specificita a selektivita metody potvrdily absenci interferujících signálů v oblasti retence Leuprolidu. LLOQ 10 pg/mL umožnilo detekci velmi nízkých koncentrací. Linearita v rozsahu 10–300 000 pg/mL vykázala korelační koeficient 0,9952. Přesnost a opakovatelnost byly v akceptovatelných mezích (RSD < 15 %). Obnova analyzovaného Leuprolidu přesahovala 70 %. Matrice efekt ovlivnil signál analyzátu (faktor 0,66–0,90), avšak po normalizaci interním standardem se faktor přiblížil hodnotě 1,07.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje spolehlivé stanovení Leuprolidu v malých objemech plazmy při úrovních pg/mL, což je klíčové pro předklinické farmakokinetické studie. Technologie LCMS-8060 se vyznačuje vysokou citlivostí a širokým dynamickým rozsahem, umožňujícím sledování látek přes pět řádů koncentrací.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodiku lze adaptovat pro další peptidové a malomolekulární léčiva v různých matricech včetně odebraných kapilár, moči či tkáňových extraktů. Další rozvoj cílí na plnou automatizaci přípravy vzorků, zvýšení průchodnosti analýz a využití vysokoteplotních zdrojů ionizace pro zvýšení citlivosti u termolabilních kompetitorů.

Závěr

Vyvinutá LC-MS/MS metoda pro stanovení Leuprolidu v potkaní plazmě je vysoce citlivá, specifická a validovaná dle mezinárodních směrnic. Umožňuje přesné a reprodukovatelné měření v širokém dynamickém rozsahu, což podporuje farmakokinetické a toxikologické studie.

Reference

• Pradeep K Vuppala Journal of Bioequivalence & Bioavailability Volume 5 Issue 4 2013
• EMA Guideline on Bioanalytical Method Validation Rev 1 Corr 2 EMEA CHMP EWP 192217 2009
• US FDA Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation Rev 1 Draft September 2013
• Japan MHLW Guideline on Bioanalytical Method Validation in Pharmaceutical Development July 2013