Targeted Peptide Quantification with Small Foot-print Capillary LC-MS/MS

Význam tématu

Quantifikace nízkoodštěpných proteinů je klíčová pro pochopení biologických drah, monitorování výrobních procesů biotechnologií a odhalování biomarkerů v proteomice. Standardní LC-MS/MS metody často dosahují nedostatečné citlivosti při omezeném objemu vzorku. Kapilární LC-MS/MS představuje efektivní alternativu, která výrazně snižuje spotřebu rozpouštědel a zlepšuje detekční limity.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo vyvinout robustní a přenosnou metodu cílené kvantifikace peptidů na platformě s malou stopou: kapilární LC (Axcend Focus) spojené s tandemovou kvadrupólovou hmotnostní spektrometrií (Agilent Ultivo TQ) v režimu MRM. Studie hodnotila:

• detekční a kvantifikační limity (LOD, LOQ),
• lineární rozsah a koeficient determinace,
• preciznost a přesnost analýzy,
• porovnání citlivosti a spotřeby rozpouštědel s běžným (standard-flow) LC-MS/MS.

Metodika a instrumentace

Vzorkem byl trypticky štěpený digest IgG1 mAb získaný z CHO buněk, do kterého byly přidány těžce izotopově značené (SIL) peptidové standardy z možných hostitelských proteinů (HCP) v rozsahu 62,5–50 000 amol. Analýza probíhala na kapilární kolonce C18 (150 µm × 100 mm, 1,8 µm) při 2 µL/min, gradient 0–85 % organiky za 5 min. Detektor Ultivo TQ pracoval v režimu MRM, optimalizace přechodů i parametry zdroje automatizovaně provedeny přes Agilent Automation tool a Skyline.

Použitá instrumentace

• Axcend Focus Capillary LC
• Agilent Ultivo Triple Quadrupole LC/MS
• Ionizace ESI pro kapilární tok; AJS pro standardní tok
• Software: Skyline, Agilent MassHunter Workstation

Hlavní výsledky a diskuse

Kapilární LC-MS/MS dosáhlo detekčních limitů až 62,5 amol pro všechny čtyři sledované peptidy, tedy dvojnásobně nižší LOD než u standard-flow AJS a 10násobně lepší oproti ESI ve standardním režimu. Linearita byla v rozsahu 62,5–50 000 amol s R2 > 0,998. Preciznost (%RSD) většinou pod 10 % a přesnost 85–115 % potvrzují robustnost metody. Kapilární přístup snížil spotřebu rozpouštědel až 250× a spotřebu plynu na čtvrtinu oproti standardnímu LC-MS.

Přínosy a praktické využití metody

Vyvinutá metoda umožňuje spolehlivou kvantifikaci stopových peptideů v komplexních matricích s vysokou citlivostí a nízkou spotřebou reagencií. Je vhodná pro QC/QA v biotechnologii, farmaceutickém vývoji a výzkumu proteinových biomarkerů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Dálková miniaturizace LC-MS pro on-site analýzy v polních podmínkách.
• Automatizace přípravy a přímá integrace s proteomickými workflow.
• Rozšíření na multiplexní kvantifikaci většího počtu HCP peptidů.

Závěr

Small foot-print kapilární LC-MS/MS platforma (Axcend Focus/Agilent Ultivo) nabízí signifikantní zlepšení citlivosti, lineárního rozsahu, preciznosti a environmentální udržitelnosti. Metoda je perspektivní pro aplikace vyžadující kvantifikaci stopových proteinových analýz.

Reference

Dong X.; Morse M.; Ward G.; Wu L.; Batoon P.; Liu M. Targeted Peptide Quantification with Small Foot-print Capillary LC-MS/MS. Poster WP 587, ASMS 2024.