Evaluation of a microfluidic electrophoresis device coupled to an Orbitrap mass spectrometer for the characterization of biotherapeutic proteins

Význam tématu

Rychlá a citlivá charakterizace bioterapeutik je nezbytná pro zajištění kvality, bezpečnosti a účinnosti lékových přípravků. Integrace mikrofluidní kapilární elektroforézy s orbitrapovou hmotnostní spektrometrií nabízí ortogonální separaci, nízkou spotřebu vzorku a vysokou rozlišovací schopnost pro analýzu intact hmoty, subjednotek i peptidové mapy.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo vyhodnotit výkonnost chipové elektroforetického zařízení ZipChip spojeného s orbitrapovým hmotnostním spektrometrem (Q Exactive HF a Q Exactive Plus) pro:

• analýzu intact hmotnosti modelové monoklonální protilátky NIST mAb,
• subjednotkovou analýzu po štěpení IdeS proteázou,
• peptidovou mapu po trypsinizaci.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky NIST mAb a trastuzumab emtansine byly připraveny v několika krocích (ředení, štěpení, redukce, alkylace a buffer exchange). Elektroforéza probíhala na ZipChip HR (908 Devices) s poli 220–500 V.

Instrumentace:

• ZipChip HR mikročip s integrovaným nanoESI emiterem
• Hmotnostní spektrometry Thermo Scientific Q Exactive HF (HMR režim) a Q Exactive Plus (proteinový režim)
• Software BioPharma Finder 2.0 pro zpracování a dekonvoluci dat

Hlavní výsledky a diskuse

Intact analýza identifikovala lysinové varianty NIST mAb s chybou hmotnosti pod 10 ppm při spotřebě pouhých desítek nanolitrů vzorku. U trastuzumab emtansine byly v čase pod 40 s rozlišeny glykoformy G0F/G1F a G1F/G1F, průměrné DAR hodnoty 3,46 a 3,47 odpovídají literatuře. Subjednotková analýza po IdeS štěpení prokázala vysokou citlivost a rozlišení lyzinových variant. Peptidová mapa po 10min separaci dosáhla >97% pokrytí sekvence lehkého a těžkého řetězce.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje:

• rychlé screenování intact hmotnosti pro QC laby,
• detailní charakterizaci posttranslačních modifikací na úrovni subjednotek i peptidů,
• šetrné a úsporné zpracování vzorku bez nutné předúpravy u heterogenních ADC.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření aplikací v biopfarmaceutickém vývoji, zejména pro on-site QC, vysoce propustnou charakterizaci a kombinace s dalšími separačními technikami. Integrace s automatizovanými platformami a rozvoj softwarové analýzy budou dále zvyšovat efektivitu a reprodukovatelnost.

Závěr

ZipChipová elektroforéza v kombinaci s orbitrapovými spektrometry nabízí rychlou, citlivou a přesnou platformu pro komplexní charakterizaci bioterapeutik na úrovni intact hmotnosti, subjednotek i peptidové mapy.

Reference

1. Marcoux et al. Protein Science. 2015 Aug;24(8):1210-23