Evaluation of a microfluidic electrophoresis device coupled to an Orbitrap mass spectrometer for the characterization of biotherapeutics proteins

Význam tématu

Rostoucí poptávka po detailní charakterizaci bioterapeutik vyžaduje rychlé, citlivé a vysoce reprodukovatelné analytické postupy, které dokáží odhalit strukturní i funkční heterogenitu.

Cíle a přehled studie

Tato studie hodnotí výkon čipem řízené mikrofluidní kapilární elektroforézy ZipChip HR ve spojení s Orbitrap hmotnostním spektrometrem pro:

• intaktní analýzu bílkovin,
• analýzu podjednotek po štěpení proteázou IdeS,
• peptidové mapování po trypsinizaci.

Použitá metodika a instrumentace

• Intaktní analýza: jednoduché ředění vzorku v destilované vodě.
• Analýza podjednotek: štěpení IdeS, denaturace guanidinem HCl, redukce DTT, výměna pufru.
• Peptidové mapování: denaturace, redukce, alkylace, trypsinové štěpení, zastavení reakce formiální kyselinou.
• Separace: ZipChip HR (908 Devices) s neutrálně hydrofilním kanálem 22 cm, integrovaný nano-ESI výtlačník, pole 500 V/220 V/400 V.
• MS: Thermo Q Exactive HF (HMR režim) pro intaktní analýzu, Q Exactive Plus (protein režim) pro podjednotky.
• Software: BioPharma Finder 2.0 pro zpracování dat.

Hlavní výsledky a diskuse

• NIST mAb: tři lysinové varianty téměř baseline oddělené, chyby hmotnosti pod 14 ppm.
• Trastuzumab emtansine: průměrné hodnoty DAR 3,45 (G0F/G1F) a 3,47 (G1F/G1F) v souladu s literaturou, chyba pod 16 ppm.
• Rychlá separace (<40 s) a miniaturní spotřeba vzorku (0,65 nL), detekce až při 0,001 µg/µL.
• Peptidové mapování dosáhlo >97 % sekvenčního pokrytí lehkého i těžkého řetězce za 10 min.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a vysoce citlivá alternativa k LC–MS s minimální přípravou vzorku.
• Vysoká propustnost a nízká spotřeba pro rutinní QA/QC.
• Detailní profilování heterogenity bioterapeutik bez rozsáhlých úprav.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace a integrace do vysokoprůtočných platforem.
• Rozšíření na konjugovaná protilátková léčiva (ADC) a další bioterapeutika.
• Vývoj nových čipových materiálů a úprav kanálů pro lepší rozlišení.
• Propojení s pokročilými MS/MS technikami pro hlubší strukturní analýzu.

Závěr

ZipChip HR v kombinaci s Orbitrap hmotnostním spektrometrem nabízí robustní, rychlé a citlivé řešení pro komplexní charakterizaci bioterapeutických bílkovin intaktně, na úrovni podjednotek i peptidově s vysokou přesností.

Reference

• Marcoux et al., Protein Sci. 2015 Aug;24(8):1210-23.