LC/MS/MS High Sensitivity Bioanalytical Method: Entecavir in Human Plasma

Význam tématu

Stanovení entekaviru v lidské plazmě představuje klíčový nástroj pro hodnocení farmakokinetiky a bioekvivalence při léčbě infekce virem hepatitidy B. Díky vysoké účinnosti entekaviru a jeho nízkým koncentracím v biologických matricích je nezbytné vyvinout metodu s maximální citlivostí, selektivitou a zároveň s minimální a rychlou přípravou vzorku.

Cíle a přehled studie

Cílem popsané práce je představit jednoduchý, rychlý a vysoce citlivý LC-MS/MS postup pro kvantitativní analýzu entekaviru v lidské plazmě využívající přístrojovou sestavu Shimadzu LCMS-8060 s UHPLC Nexera X2. Studie se zaměřuje na eliminaci složitých extrakčních kroků při zachování přesnosti a opakovatelnosti měření.

Použitá metodika a instrumentace

Pro předúpravu plazmy byla zvolena jediná fáze proteinové precipitace:

• Přidání chlazené směsi acetonitrilu/methanolu (1:1) k plazmě
• Vortexování a odstředění při 13 000 rpm
• Filtrace supernatantu přes 0,2 µm nylonový filtr

UHPLC separace:

• Kolona: Kinetex Phenyl-Hexyl 2,6 µm, 150 × 2,1 mm
• Mobilní fáze A: voda s 5 mM formiátu amonného a 0,01 % kyseliny mravenčí
• Mobilní fáze B: methanol s 5 mM formiátu amonného a 0,01 % kyseliny mravenčí
• Gradient: 5 % B → 90 % B (0,5–5,0 min), návrat na 5 % B (7,5 – 10,0 min)
• Průtok: 0,3 mL/min, teplota kolony 40 °C, objem injekce 1 µL

MS/MS detekce:

• ESI pozitivní režim, zahřátý ionizační zdroj
• MRM přechody: 278 → 152 (quantifier), 278 → 135 (qualifier)
• Teploty: zdroj 300 °C, blok 400 °C, DL 250 °C
• Plyny: dusík pro nebulizaci (2,0 L/min) a sušení (10,0 L/min), Ar pro CID (270 kPa)

Hlavní výsledky a diskuse

LLOQ metody dosahuje 10 pg/mL v post-spiked plazmě (S/N≈10) při objemu injekce 1 µL (efektivně 40 pg/mL před precipitací). Kalibrační křivka je lineární v rozsahu 10–10 000 pg/mL s korelačním koeficientem R2 > 0,999. Přesnost a preciznost QC vzorků (LLOQ, nízká, střední, vysoká koncentrace) jsou v mezích ±15 % a RSD < 15 %. Obnova analyty dosahuje 95–114 % a matriční efekt ukazuje iontové zesílení kolem 167 % (±13 %). Opakované injekce LLOQ vzorků prokázaly vysokou reprodukovatelnost chromatogramů.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda zkracuje čas a náklady na přípravu vzorků díky eliminaci SPE/LLE kroků, nabízí vysokou propustnost a robustnost pro rutinní farmakokinetické, bioekvivalenční a QA/QC studie entekaviru.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další optimalizace by mohla směřovat k potlačení matričního efektu, využití ještě rychlejších hmotnostních spektrometrů a automatizované přípravě vzorků. Integrace multiplexních analýz a online extrakčních systémů zvýší efektivitu a rozšíří aplikační spektrum na další nukleozidové analogy.

Závěr

Byla vyvinuta a validována jednoduchá, rychlá a vysoce citlivá LC-MS/MS metoda pro kvantifikaci entekaviru v lidské plazmě s minimální předúpravou vzorku, splňující požadavky na přesnost, preciznost a citlivost pro bioanalytické aplikace.

Reference

• 1. D. Zhang et al. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 49 (2009) 1027–1033
• 2. B.R. Challa et al. Journal of Chromatography B 879 (2011) 769–777
• 3. S. Sythana et al. International Journal of PharmTech Research 4 (2012) 1721–1729