New To HPLC - Avoiding Beginner Pitfalls

Význam tématu

High-performance liquid chromatography (HPLC) patří mezi nejrozšířenější analytické techniky. Přesto při nedostatečné znalosti instrumentace, kolony, přípravy mobilní fáze a vzorku vznikají běžné chyby, které snižují kvalitu a reprodukovatelnost výsledků.

Cíle a přehled studie / článku

Článek zaměřený na identifikaci a prevenci základních chyb začátečníků v HPLC rozebírá problematiku špatných spojů, vhodného výběru detektorů, tubingu, kolony a metodických podmínek. Autorka Rita Steed představuje příklady problémových chromatogramů a navrhuje konkrétní doporučení pro ladění metod.

Použitá instrumentace

• Analytické LC systémy Agilent (1100, 1200, 1290)
• Detektory UV/DAD, MS, RI, ELSD, FLD, ECD
• Různé objemy flow cell a jejich výběr podle rychlosti gradientu a druhů kolony
• Swagelok fitinky, polyketonové a PEEK spojky, tubusáž 0,12 a 0,17 mm ID
• In-line filtry 0,2–2 µm a měření dwell volume (objemu ekviproběhu)

Použitá metodika

• Analýza vlivu extra-column volume na účinnost (N), rozlišení (Rs) a symetrii píků
• Optimalizace délky a průměru potrubí mezi autosamplerem a kolonou
• Výběr a příprava mobilní fáze: složení (organika, voda, pH), filtrace, prevence mikrobiálního růstu
• Zkoumání vlivu pH a teploty na retenci ionizovatelných sloučenin a životnost kolony
• Příprava vzorku: čištění, SPE, filtrace syringem, volba injekčního objemu
• Postupy čištění a regenerace kolony pro prodloužení její životnosti

Hlavní výsledky a diskuse

• Příklad špatného fittingu vedl k tailingu a ztrátě symetrie píků, oprava spojů vedla k ostrým vrcholům.
• Snížení extra-column volume z 8,6 na 3,0 µL zvýšilo účinnost až o 60 %.
• Ukázky rozdílů selektivity C18 kolony s částicemi 5, 3,5 a 1,8 µm a lot-to-lot odchylek.
• Vliv pH mobilní fáze na retenci kyselin a bází, optimalizace pH pro stabilní lot-to-lot výkonnost.
• Změny teploty upravují retenční faktory a mohou zlepšit či zhoršit tvar píku, kritické pro termolabilní analyty.
• Identifikace ghost peaks z nečistot v organice, přísadách i ve vodě a doporučení pro jejich eliminaci.

Přínosy a praktické využití metody

Implementovaná doporučení vedou k výraznému zlepšení reprodukovatelnosti, vyšší účinnosti separace a ostřejší symetrii píků. Minimalizace extra-column volume, správná údržba fittings, filtrace vzorků a vhodný výběr detektoru zrychlují rutinní provoz i řešení potíží v laboratoři.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj směřuje k ultra vysokotlaké HPLC (UHPLC) s použitím sub-2 µm částic, inertním povrchům kapalinových cest a pokročilé automatizaci připojení a čištění. Rozšíří se integrace on-line filtrace, výkonnější detektory a metodiky pro rychlou kvalifikaci nových kolonových materiálů.

Závěr

Důkladné porozumění instrumentálním parametrům a metodickým podmínkám je klíčem k robustnímu provozu HPLC. Prevencí základních chyb lze výrazně zvýšit kvalitu dat, šetřit čas i náklady.