Gradient Design and Development

Význam tématu

Gradientová eluce reversed-phase HPLC umožňuje efektivní separaci složek s širokým rozsahem polarity a molekulárních hmotností. Odstraňuje omezení isokratických metod, zkracuje dobu analýzy a zlepšuje rozlišení při zachování vysoké účinnosti kolon.

Cíle a přehled studie / článku

Dokument popisuje zásady návrhu, optimalizace a přenosu gradientních metod v reversed-phase HPLC. Představuje klíčové kroky od stanovení objemových charakteristik systému až po finální metody se zkráceným časem běhu.

Použitá metodika a instrumentace

• HPLC systémy Agilent (řada 1200, InfinityLab) s teplotní kontrolou (25–40 °C)
• Kolony Poroshell 120 EC-C18 (2,7 μm) v rozměrech 4,6×150, 4,6×100, 4,6×50 a 3,0×30 mm; ZORBAX Eclipse Plus-C18 (5 μm)
• Mobilní fáze: voda s 0,1 % kyseliny mravenčí nebo fosfátový/acetátový pufr (pH 6,8–6,9) a acetonitril/methanol
• Detekce UV při 245 a 265 nm (2 μl flow cell)
• Metoda měření zpožděného objemu (dwell volume) pomocí gradientu 0–100 % acetonu ve vodě

Hlavní výsledky a diskuse

• Gradientová eluce zkracuje dobu analýzy až dvakrát ve srovnání s isokratickými běhy při zachování nebo zlepšení rozlišení
• Dwell volume a extracolumn objemy významně ovlivňují tvar a retenci špiček
• Scouting gradientu 5–95 % organické fáze v 10–15 minut odhalí optimální rozsah pro finální metodu
• Úprava počátečního a konečného % organické fáze může ušetřit až 50 % času metody
• Teoretické modely s parametry k* a strmosti gradientu b umožňují přesný přepočet metod mezi kolonami různých dimenzí

Přínosy a praktické využití metody

Gradientové metody nacházejí uplatnění zejména v analýze:

• Banned azobarviv v textiliích
• Farmaceutických nečistot a pesticidů (karbamáty, acetaminofenové nečistoty)
• Peptidů a proteinů v biochemii a biologickém výzkumu

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření UHPLC a mikro-LC pro vyšší účinnost a snížení spotřeby rozpouštědel
• Automatizované nástroje pro dynamický scouting a optimalizaci gradientů
• Kombinace s hmotnostní spektrometrií a multidimenzionální chromatografií (2D-LC)
• Real-time monitoring a online úprava podmínek během běhu

Závěr

Správné navržení a přenos gradientních metod vyžaduje pochopení objemových vlastností chromatografického systému, optimalizaci rozsahu % organické fáze a aplikaci teoretických vztahů. Tím lze dosáhnout rychlých, vysoce účinných a přenosných HPLC metod s vynikajícím rozlišením.

Reference

• Altiero P. Gradient Design and Development, Agilent Technologies, September 2019
• Dolan J. Making the most of a Gradient Scouting Run, LCGC North America, Vol. 31, No. 1, 2013