Performance Evaluation of a Modified Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer

Význam tématu

Studium proteomiky a charakterizace intactních bílkovin je klíčové pro pochopení biologických procesů, vývoj léčiv a kontrolu kvality v biotechnologickém průmyslu. Vysoce výkonné orbitrapové hmotnostní spektrometry poskytují vysoké rozlišení, přesnou hmotnostní analýzu a možnost rychlého screeningu, což zlepšuje citlivost i spolehlivost měření.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyhodnotit výkonnost nového přístroje Thermo Scientific™ Orbitrap Exploris™ 480 při experimentech založených na Data Dependent Acquisition (DDA) a Data Independent Acquisition (DIA), dále zkoumat multiplexní kvantifikaci TMT11plex s TurboTMT opčním módem a kompenzační voltmetrii FAIMS. Pro srovnání byly použity standardy HeLa a kvasinkového digestu a jako referenční přístroj sloužil Q Exactive™ HF-X.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: HeLa a Saccharomyces cerevisiae proteolytické digesty, TMT11plex značené vzorky, směsi v poměru 1:1 a kvasinkové spike-in poměry 2, 5, 10.
Separace: EASY-nLC 1200 nebo Ultimate 3000 RSLCnano, C18 kolony PepMap (15–25 cm × 150 µm), gradienty 5–60 min.
Režimy měření:

• DDA: FS rozlišení 60k, TopN 20, MS/MS rozlišení 15k.
• DIA: variabilní délky gradientů, 7,5k MS/MS rozlišení.
• TurboTMT: 15k a 30k MS/MS rozlišení s transienty 32 ms a 64 ms, využití ΦSDM.
• FAIMS Pro: jednotlivé a kombinované CV (-40, -55, -65, -70 V).

Data analýza: Proteome Discoverer 2.4, SEQUEST HT, FDR < 1 %, TMT kvantifikace s tolerancí reporter iontů ±20 ppm.
Významné části instrumentace:

• High Capacity Transfer Tube (HCTT) a RF ion funnel pro zvětšený iontový tok.
• Advanced Active Beam Guide (AABG) pro eliminaci neutrálů.
• Advanced Quadrupole Technology (AQT) s optimalizovaným tvarem izolace.
• Independent Charge Detector (ICD) a Ion Routing Multipole pro dynamickou akumulaci a HCD fragmentaci.
• Ultra-High-Field Orbitrap analyzátor s rozlišením až 480 000 a snímkovací frekvencí do 40 Hz.

Hlavní výsledky a diskuse

V DDA experimentech přístroj v triplikátech identifikoval až 55 000 peptidů a 5 500 proteinových skupin v 60min gradientu, což je srovnatelné s Q Exactive HF-X (~39 000 peptidů, ~4 800 proteinů). Při krátkých gradientech (5–13 min) byly reprodukovatelné identifikace >6 000 peptidů a >1 000 proteinů.
TurboTMT zvýšil počet identifikovaných/kvantifikovaných peptidů o ~30 % při 500 ng vzorku. FAIMS jedno CV přinesl mírný úbytek, ale kombinované CV přidaly až 35 % více identifikací.
V DIA režimu s 5 min gradientem bylo identifikováno ~2 000 proteinů s >87 % kvantifikovatelných s CoV <20 %, u delších gradientů se kvantifikovatelnost zvyšovala až na 93 %.
Analýza intactních monoklonálních protilátek (Herceptin) v nativním i denaturačním módu umožnila potvrzení glykoformních poměrů a hmotností.
Label-free kvantifikace spike-in modelu kvasinek v pozadí HeLa vykazovala přesnost lepší než 10 % a dobrou preciznost pro poměry 2, 5 a 10.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká propustnost a flexibilita pro rychlé i dlouhé chromatografické gradienty.
• Špičkové rozlišení a rychlost orbitrapového analyzátoru vhodné pro komplexní proteomické studie.
• Možnost multiplexního značení TMT s vyšší efektivitou a prohloubením pokrytí proteomu.
• FAIMS integrace pro zlepšení hloubky identifikace u komplexních vzorků.
• Intact protein analysis vhodné pro biopharmaceutické kontroly kvality mAb.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj lze očekávat v integraci víceúrovňových selektivních iontových filtrací (FAIMS, TIMS), optimalizaci algoritmů pro zpracování ve spektrální dekonvoluci a využití strojového učení pro interpretaci dat. Vhodné nasazení v single-cell proteomice a klinických aplikacích.

Závěr

Orbitrap Exploris 480 nabízí kompaktní konstrukci, robustní výkon a flexibilitu pro DDA, DIA i multiplexní experimenty. Jeho schopnosti plně vyrovnávají nebo překonávají předcházející modely a vyhovují nárokům moderní proteomiky a biopharma průmyslu.

Reference

1. O. Lange et al. Int. J. Mass Spectrom. 377 (2015) 338–344.
2. G. Grinfeld et al. Anal. Chem. 2017, 89(2), 1202–1211.
3. A. S. Hebert et al. Anal. Chem. 2018, 90(15), 9529–9537.
4. T. Shalit et al. J. Proteome Res. 2015, 14, 1979–1986.