Development of Microflow LC-MS/MS Method for Vitamins and Steroids in Complex Matrix for Research Purposes

Význam tématu

Analýza vitaminů D a jejich metabolitů spolu s testosteronem v biologických maticích představuje náročný úkol vzhledem k nízké ionizační efektivitě a blízkým strukturním vlastnostem analyzovaných látek. Minimalizace přípravy vzorku s využitím mikroflow LC-MS/MS umožňuje zvýšit citlivost, zkrátit dobu analýzy a zlepšit robustnost metody pro biochemické a klinické výzkumné aplikace.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a ověřit mikroflow LC-MS/MS metodu pro kvantifikaci vitaminu D (D2, D3, 25-OH D, 1,25-OH D) a testosteronu v lidské séru s minimální preparativní úpravou vzorku. Použití kapilárního průtokoměru při 5 µl/min a přístrojové konfigurace na platformě Thermo Scientific mělo umožnit dosažení vysoké citlivosti a selektivity bez nutnosti chemické derivatizace.

Použitá metodika a instrumentace

• Příprava vzorku: precipitace lidského séra acetonitrilem v poměru 1:2, injekce supernatantu.
• Chromatografie: UltiMate 3000 RSLCnano pumpa s kapilárním průtokoměrem, gradient 40 %–1 %–99 % mobilní fáze A/B při 5 µl/min.
• Hmotnostní spektrometrie: TSQ Quantiva triple quadrupole se zdrojem HESI II vybaveným užší kapilární jehlou pro vyšší citlivost.
• Mikroflow alternativně: Prelude SPLC pumpy při 50 µl/min.
• Software: TraceFinder 4.1 pro kvantifikaci, Freestyle pro zpracování SRM chromatogramů.

Hlavní výsledky a diskuse

Při optimalizaci SRM přechodů pro vitamin D poskytl fragment [M-H2O+H]+ oproti [M+H]+ až 15× vyšší citlivost. Metoda dosahovala rozlišení všech vitaminových isomerů na 15minutovém gradientu. Lineární rozsahy detekce byly 0,05–100 ng/ml pro vitaminy a 0,01–100 ng/ml pro testosteron s korelačními koeficienty r2 > 0,99. Reprodukovatelnost (RSD) i přesnost výsledků se pohybovaly pod 15 %. LLOQ pro vitamin D v séru činilo 250 pg/ml (5 µl injekce), pro testosteron 100 pg/ml (2 µl injekce) a 50 pg/ml při optimalizaci. Použití Prelude SPLC při 50 µl/min vedlo k trojnásobnému až čtyřnásobnému zvýšení signálu oproti konvenčnímu 400 µl/min.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost a selektivita umožňují spolehlivou kvantifikaci nízkokoncentrovaných molekul v komplexním matrice.
• Robustní provoz mikroflow LC minimalizuje potřebu uživatelských zásahů a prodlužuje intervaly mezi údržbou.
• Rychlá příprava vzorku bez derivatizace zkracuje celkovou dobu analýzy a nároky na pracovní postupy v laboratoři.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikace na další klinicky relevantní malé molekuly a metabolity.
• Dlouhodobé studie robustnosti systému a vlivu různých čističek vzorků.
• Optimalizace kvadraturního rozlišení pro snížení chemického pozadí a zvýšení detekčního výkonu.

Závěr

Vyvinutá mikroflow LC-MS/MS metoda na platformě UltiMate 3000 RSLCnano a TSQ Quantiva prokázala vysokou citlivost, selektivitu a reprodukovatelnost při kvantifikaci vitaminů D a testosteronu v lidském séru s minimální přípravou vzorku. Alternativní použití Prelude SPLC mikroflow pump přináší dalších několiknásobný nárůst signálu bez ztráty robustnosti.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific UltiMate 3000 RSLCnano s kapilárním průtokoměrem
• Thermo Scientific TSQ Quantiva triple quadrupole
• HESI II ionizační zdroj s úzkou kapilární jehlou
• Thermo Scientific Prelude SPLC mikroflow pumpy
• Software Thermo Scientific TraceFinder 4.1 a Freestyle