A Novel Instrumental Strategy for Parallel Reaction Monitoring of Intact Proteins with an Orbitrap Analyzer

Význam tématu

Top-down analýza intaktních proteinů čelí omezením citlivosti i výtěžnosti identifikací, protože signál jednotlivých proteinů je rozložen do desítek nábojových stavů. Tradiční jednovidové (single-window) izolace v kvadrupólu ztrácí až řád citlivosti při práci s většími molekulami. Vyvinutí paralelní multiplexní selekce před fragmentací představuje klíč k dosažení vyšší citlivosti a rychlosti cílených i pan-omických experimentů.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo demonstrovat novou instrumentální strategii pro současnou selekci více m/z oken intaktních proteinů v kvadrupól-Orbitrap přístroji. Metoda kombinuje ortogonální lineární čas-of-flight separator s paralelním pulzním výběrem před dalšími kroky HCD fragmentace a vysokou přesností Orbitrap detekce. Studie využívá simulace i první experimentální ověření na modelových směsích včetně ubiquitinu.

Použitá metodika

Optimalizace byla provedena na kalibrační směsi obsahující n-butylamin, kofein, peptid MRFA a Ultramark ve vodě/acetonitrilu s 0,1 % kyseliny octové (infuze 0,3 µL/min). Pro model intaktních proteinů byl použit roztok ubiquitinu 1 µM. Princip paralelní selekce využívá třífázové časové pulzy („deflection gate“, „bouncer“ a ortogonální pulser) umístěné mezi zdrojem a C-trapem.

Použitá instrumentace

• Thermo Q Exactive Orbitrap s H-ESI II iontovým zdrojem
• Modifikovaný kvadrupól nahrazen kolizním článkem a lineárním TOF separator
• Vstřikovací flatapólová filtrace (injection flatapole mass filter)
• HCD kolizní buňka se zvýšeným přívodem plynu
• Deflection gate, bouncer pulser, ortogonální pulser se synchronizovaným časováním
• Vlastní PCB moduly, upravený Tune program a embedded software

Hlavní výsledky a diskuse

Simulace prokázaly, že kombinace dráhového pulzování (gate ZG), deflection gate a bounceru umožňuje výběr užšího m/z rozsahu bez ztrát iontů mimo zájem. Aktivace bounceru zlepšuje fokusaci částic orthogonálně k ose akcelerace a umožňuje zachytit vybrané ionty v C-trapu. Panoramatické spektrum kalibrace i ubiquitinu ukázalo výrazné potlačení nežádoucích m/z stavů a potvrzení paralelní selekce dvou oken najednou.

Přínosy a praktické využití metody

• Podstatné zvýšení citlivosti cílených a top-down experimentů díky paralelní selekci více nábojových stavů
• Rychlejší analýza s vyšším počtem identifikací na jednotku času
• Možnost aplikace v monitoringu intaktních proteinů, komplexů i peptidů v MRM/DIA režimech
• Minimalizace ztrát signálu při izolaci větších biomolekul

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření studie na bezztrátovou injekci iontů do TOF sekce, vícefázové pulzní výběry m/z oken a optimalizaci zachytávání fragmentů v HCD buňce. Důležitým cílem je implementace MS3 strategie pro analýzu intaktních proteinových komplexů, kde MS2 krok rozloží komplex na podjednotky a MS3 detailně mapuje jejich backbone fragmenty. Další rozvoj by mohl přinést integraci s ultrarychlou chromatografií a automatizované parametrové skenování.

Závěr

Nová paralelní multiplexní selekce pomocí ortogonálního TOF separatoru v kvadrupól-Orbitrap přístroji prokázala schopnost zvýšit citlivost a selektivitu top-down a cílených experimentů. Probíhající práce směřují k optimalizaci bezztrátové iontové injekce, rozšíření počtu oken a k nasazení MS3 protokolů pro detailní rozklad proteinových komplexů.

Reference

• A. Catherman et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 445 (4), 2014, 683–693.
• M. Belov et al., Anal. Chem., 2013; 85(23): 11163–11173.