A Single Analytical Platform for Glycan Analysis, Charge Heterogeneity, and Purity Determination of the NISTmAb

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) představují klíčovou třídu bioterapeutik, u nichž glykanová mikroheterogenita, nábojová heterogenita a nečistoty mohou ovlivnit jejich bezpečnost, stabilitu a účinnost. Komplexní charakterizace těchto atributů je proto zásadní jak během výroby, tak skladování mAb přípravků. Tradičně vyžaduje řadu separačních a detekčních technik s časově náročnou přípravou vzorku.

Cíle a přehled studie

Cílem této práce bylo ukázat, že jediná analýza pomocí kapilární elektroforézy na systému SCIEX PA 800 Plus dokáže paralelně vyhodnotit:

• N-glykanovou mikroheterogenitu
• Nábojovou heterogenitu
• Cistotu

Jako objekt byla zvolena referenční mAb látka NISTmAb (RM 8671), přičemž se využilo univerzální kazety EZ-CE a Fast Glycan Technology pro zrychlení a zjednodušení workflow.

Použitá metodika a instrumentace

Pro glykanovou analýzu:

• Kapilární elektroforéza s laser-indukovanou fluorescencí (CE-LIF)
• On-bead štěpení N-glykanů enzymem PNGase F při 60 °C
• Fluorescenční značení aminopyren-trisulfonátem (APTS)
• EZ-CE kazeta a Fast Glycan Technology – kompletní příprava vzorku do 60 min

Pro nábojovou variantní profilaci:

• Capillary zone electrophoresis (CZE) na EZ-CE kazetě (20 cm efektivní délka)
• Napětí 12 kV, teplota 20 °C

Pro stanovení čistoty:

• Redukovaný a neredukovaný režim na krátké straně EZ-CE kazety (10 cm)
• Automatizovaná aplikace z PA 800 Plus Application Guide

Hlavní výsledky a diskuse

Glykanová analýza:

• Rozlišení 26 glykanových izomerů během 5 minut
• Hlavní glycany: G0F (41,5 % ± 2,96 % RSD), G1F (26,9 % ± 2,17 %), G1’F (8,94 % ± 2,51 %), G2F (6,10 % ± 2,50 %)
• Migration time RSD < 0,35 %

Nábojová profilace:

• Základní varianty: 11,71 % ± 0,09 % (migration time RSD 0,47 %)
• Hlavní frakce: 72,99 % ± 0,15 % (migration time RSD 0,45 %)
• Kyselé varianty: 15,29 % ± 0,09 % (migration time RSD 0,44 %)

Stanovení čistoty:

• Glykanová obsazenost: 99,42 % ± 0,02 %
• Monomerická čistota: 94,45 % ± 0,04 %
• Peak area RSD ≤ 0,5 %, migration time RSD ≤ 0,33 %

Všechny výsledky byly ve velmi dobré shodě s daty NIST, přičemž nižší šum a ploché pozadí umožnily přesnější integraci fragmentů.

Přínosy a praktické využití metody

Toto řešení nabízí:

• Komplexní charakterizaci mAb na jediné platformě
• Zrychlené a zjednodušené přípravy vzorku
• Vysokou reprodukovatelnost a přesnost vhodnou pro QC v bioprodukci
• Snížení nároků na personál i provozní náklady

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může zahrnovat:

• Integraci s hmotnostní spektrometrií pro strukturu glykanů
• Automatizované online monitory během výrobního procesu (PAT)
• Nové fluorescenční markery pro vyšší citlivost
• Vyšší propustnost datově náročné analýzy

Závěr

Systém SCIEX PA 800 Plus spolu s EZ-CE cartridge a Fast Glycan Technology představuje efektivní a spolehlivou platformu pro simultánní sledování glykanové mikroheterogenity, nábojové heterogenity a čistoty mAb, přičemž dosahuje výsledků srovnatelných s referenčními metodami NIST.

Reference

1. Guttman A. et al. Fast Glycan Labeling and Analysis: High-Resolution Separation and Identification in Minutes. SCIEX Technical Note; 2017.
2. Santos M. Analysis of Monoclonal Antibody Charge Variants by Capillary Zone Electrophoresis. Beckman Coulter Technical Note; 2012.
3. IgG Purity/Heterogeneity. SCIEX PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System Application Guide.
4. Gallegos-Perez J. IgG Purity/Heterogeneity and SDS-MW Assays with High Speed Separation Method and High Throughput Tray Setup. SCIEX Technical Note; 2015.
5. Guttman A. et al. Fast Glycan Sequencing Using a Fully Automated Carbohydrate Sequencer. SCIEX Technical Note; 2017.
6. National Institute of Standards and Technology. Report of Investigation: Reference Material 8671, NISTmAb. 2016.
7. Michaels DA. et al. Separation Methods and Orthogonal Techniques. In: Schiel JE, ed. Biopharmaceutical Characterization: The NISTmAb Case Study. ACS; 2015.