Differentiation of α2,3 and α2,6 Sialic Acid Linked Glycan Isomers using SelexION® Differential Mobility Spectrometry Technology

Význam tématu

Proteinová glykosylace patří mezi nejrozšířenější a nejkomplexnější post-translační modifikace. Sialové kyseliny koncové na glykánových řetězcích ovlivňují biologické procesy včetně imunoregulace a vazby patogenů. Konfigurace vazby (α2,3 versus α2,6) určuje biologickou aktivitu a je spojena například s progresí metastáz v některých nádorových onemocněních. Pro vývoj biofarmak je přesná charakterizace sialylace klíčová pro zajištění funkce a bezpečnosti léčivých proteinů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo ověřit schopnost diferenciální mobilitní spektrometrie (DMS) SelexION oddělit izomerní glykany s α2,3- a α2,6-vazbou sialových kyselin. Analýza zahrnovala malé trisacharidové páry i větší di-sialylované biantennární glykany. Klíčové bylo demonstrovat, že DMS poskytuje ortogonální selektivitu před hmotnostní spektrometrií a usnadňuje definitivní identifikaci izomerů.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky komerčně dostupných glykánů byly připraveny v roztoku acetonitril/voda (20:80, v/v) s 10 mM ammonium hydrogenuhličitanu a infundovány rychlostí 5 µL/min. SelexION DMS buňka byla integrována do atmosférické oblasti mezi sampling orifice a IonDrive Turbo V zdrojem na SCIEX QTRAP 6500/6500+. Teplota buňky byla udržována na 150 °C, proud dusíku 30 psi a do nosného plynu byl přidán metanol (1,5 mol%). Skenovala se separation voltage (SV) a compensation voltage (CoV). Identifikace glykánů probíhala pomocí MRM a lineárního iontového pastu MS/MS.

Hlavní výsledky a diskuse

DMS umožnila spolehlivé rozlišení α2,3- a α2,6-vazeb díky odlišné interakci izomerů s methanolem, přičemž α2,3-izomery vykazovaly více negativní CoV než α2,6-izomery. Úspěch byl potvrzen na dvou párech trisacharidů (Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc / Neu5Acα2-6Galβ1-4Glc a Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAc / Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAc) a na větších di-sialylovaných biantennárních glykanech s diagnostickými fragmenty m/z 306 a m/z 655 pro α2,6. Srovnání s jinými iontově mobilitními technikami ukázalo, že SelexION dokáže rozlišit i fucosylované a Neu5Gc glykany, které zůstávají u alternativ neoddělené.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda přidává ortogonální úroveň selektivity před hmotnostní spektrometrií, zrychluje analýzu izomerických glykánů a zvyšuje robustnost identifikace. Je vhodná pro charakterizaci sialylace biofarmak v QA/QC, pro výzkum funkce glykánů v onkologii, imunologii a vývoj nových diagnostických nástrojů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalšími směry jsou optimalizace chemických modifikátorů pro rozšíření oblasti aplikací, integrace DMS s kapalnou chromatografií pro vyšší rozlišení, rozvoj vysokopropustných platforem pro glykomické studie a rozšíření analýzy na vzácné glykany jako Neu5Gc či různé fukosylo­vané formy.

Závěr

SelexION DMS s metanolovým modifikátorem prokázal schopnost efektivně rozlišit α2,3- a α2,6-sialylované glykany napříč různými velikostmi. Metoda nabízí robustní a ortogonální přístup k analýze izomerických glykánů, který je hodnotný pro biopharmaceutický vývoj a glykomické výzkumy.

Reference

1. Varki A. Trends Mol Med. 2008;14(8):351–360.
2. Tsuji S. J Biochem. 1996;120(1):1-13.
3. Wang P. J Cancer Mol. 2005;1(2):73-81.
4. Jørgensen T, Berner A, Kaalhus O, Tveter KJ, Danielsen HE, Bryne M. Cancer Res. 1995;55(9):1817-1819.
5. Wang FL et al. Cancer Detect Prev. 2009;32(5-6):437-443.
6. Jefferis R. Nat Rev Drug Discov. 2009;8(3):226-234.
7. Schneider BB, Covey TR, Coy SL, Krylov EV, Nazarov EG. Int J Mass Spectrom. 2010;298(1-3):45-54.
8. Maccarone AT, Duldig J, Mitchell TW, Blanksby SJ, Duchoslav E. J Lipid Res. 2014;55(8):1668-1677.
9. Campbell JL, Baba T, Liu C, Lane CS, Le Blanc JCY, Hager JW. J Am Soc Mass Spectrom. 2017;28(7):1374-1381.
10. Harvey DJ, Rudd PM. Int J Mass Spectrom. 2011;305(2-3):120-130.
11. Campbell JL, Zhu M, Hopkins WS. J Am Soc Mass Spectrom. 2014;25(9):1583-1591.
12. Liu C, Le Blanc JCY, Shields J, Janiszewski JS, Ieritano C, Ye GF, Hawes GF, Hopkins WS, Campbell JL. Analyst. 2015;140(20):6897-6903.
13. Liu C et al. ACS Cent Sci. 2017;3(2):101-109.
14. Guttman M, Lee KK. Anal Chem. 2016;88(10):5212-5217.
15. Hinneburg H, Hofmann J, Struwe WB, Thader A, Altmann F, Varón Silva D, Seeberger PH, Pagel K, Kolarich D. Chem Commun. 2016;52(23):4381-4384.
16. Barroso A, Giménez E, Konijnenberg A, Sancho J, Sanz-Nebot V, Sobott F. J Proteome. 2018;173:22-31.
17. Lane CS et al. Anal Chem. 2019;91:9916-9924.