N-Glycan Analysis of ACE2 as SARS-CoV-2 Receptor

Význam tématu

Sialové kyseliny na koncích glykosidů hrají klíčovou roli v interakcích buněk s patogeny, především u virové infekce. Rozlišení vazebných izomerů α2,3 a α2,6 je zásadní pro pochopení specificity virů, včetně SARS-CoV-2, který využívá ACE2 jako vstupní bod. Kvalitní analýza glykosylace klíčových receptorů pomáhá ve vývoji diagnostiky a terapií.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo demonstrovat využití SialoCapper-ID kitu v kombinaci s MALDI-TOF MS (MALDI-8020) pro rychlé stanovení typu vazby sialových kyselin v N-glykanech ACE2. Studie ukazuje jednoduchý postup bez potřeby separace LC nebo enzymatické štěpení sialidázou.

Použitá instrumentace

• MALDI-TOF spektrometr MALDI-8020
• GL-Tip Amide čisticí kolony
• SialoCapper-ID Kit (SALSA derivatizace)
• Reverzní enzym PNGase F, DTT, SDS, NP-40
• 2-aminobenzamid (AB) pro značení redukčního konce
• Super-DHB matrix (2,5-dihydroxybenzoová kyselina a 5-methoxysalicylová kyselina)

Použitá metodika

• Denaturace a redukce ACE2 (SDS, DTT), uvolnění N-glykanů PNGase F o/n při 37 °C
• Derivatizace sialových zbytků SALSA metodou – amidace α2,6 isopropylaminem, α2,3 methylaminem
• Čištění derivatizovaných glykanů GL-Tip Amide
• Značení redukčního konce 2-aminobenzamidem a odstranění přebytku reagens
• MALDI-TOF MS analýza: nanesení vzorku a matrix na desku, měření v lineárním módu

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza odhalila komplexní typy N-glykanů s různým stupněm sialylace a fukosylace. Relativní intenzity špiček umožnily kvantifikovat poměr neutrálních a sialylovaných glykanů a rozlišit vazbu α2,3/α2,6. Rekombinantní ACE2 obsahovalo vyšší podíl α2,3-sialylace ve srovnání s α2,6. Tabulka sumarizovala hlavní glykanové formy s m/z hodnotami, počtem hexóz, N-acetylhexosaminů, fukózy a derivatizovaných sialových zbytků.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá MS-based identifikace vazebných izomerů bez LC separace
• Jednoduché stabilizování sialických zbytků během přípravy
• Souběžná detekce neutrálních i kyselých glykanů
• Možnost přesného kvantitativního srovnání glykanů

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na komplexní glykoproteomické studie u různých receptorů a virů
• Integrace s kvantitativními technikami a detekcí v reálném čase
• Využití v farmaceutické kontrole jakosti a v identifikaci biomarkerů
• Další vývoj derivatizačních kitů pro širší repertoár glykánů

Závěr

Metoda SialoCapper-ID ve spojení s MALDI-TOF MS umožňuje efektivní diferenciaci izomerů sialových kyselin α2,3/α2,6 jedním měřením. Aplikace na ACE2 model potvrzuje její hodnotu pro výzkum virové infekce a glykanální charakterizaci.

Reference

1. Shajahan A et al. Comprehensive Characterization of N- and O-Glycosylation of SARS-CoV-2 Human Receptor Angiotensin Converting Enzyme 2. Glycobiology, 2020, in press.
2. Nishikaze T et al. Differentiation of Sialyl Linkage Isomers by One-Pot Sialic Acid Derivatization for Mass Spectrometry-Based Glycan Profiling. Anal. Chem., 2017, 89:2353–2360.
3. Hanamatsu H et al. Sialic acid Linkage Specific Derivatization of Glycosphingolipid Glycans by Ring-Opening Aminolysis of Lactones. Anal. Chem., 2018, 90:13193–13199.