Microflow Chromatography Provides Improved Sensitivity and Coverage of Polar Metabolites for Targeted Metabolomics

Význam tématu

Metabolomická analýza hraje klíčovou roli při objevování nových terapeutických cílů, hodnocení toxicity a sledování vlivu stravy či životního prostředí na zdraví. Identifikace a kvantifikace polárních metabolitů v moči, plazmě či buněčných extraktech je zásadní pro potvrzení biomarkerů onemocnění a pochopení metabolických drah. Tradiční RP-LC–MS/MS často selhává v detekci extrémně polárních sloučenin. Nasazení microflow HILIC-LC-MS/MS výrazně zvyšuje citlivost i rozsah pokrytí metabolomu, přičemž zároveň snižuje spotřebu rozpouštědel a provozní náklady.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout robustní a vysoce citlivý mikroflow HILIC LC-MRM workflow pro cílenou analýzu přes 300 polárních metabolitů v komplexních biologických matricích (moči, plazma, MDCK buňky). Konfigurace spojuje M3 MicroLC, kolonu Luna NH₂ a QTRAP 6500+ s IonDrive™ Turbo V zdrojem pro rychlé ± polarity přepínání a monitoring 363 MRM přechodů v jediném 30minutovém běhu.

Použitá metodika a instrumentace

• Příprava vzorku: odvodnění proteinu acetoni­tril–acetone–methanol (8:1:1), sušení v TurboVap, re‐re‐suspendace v 100 % organického HILIC pufru (95 % ACN + 5 % fáze A, pH 9).
• Analytická LC: SCIEX ExionLC HPLC, Luna 3 µm NH₂ (150×4,6 mm), flow 350 µL/min, gradient 100→2→100 % B.
• Microflow LC: SCIEX M3 MicroLC, Luna 3 µm NH₂ (150×0,3 mm) s 1 µm pre-filtrací, flow 10 µL/min, stejný gradient.
• MS/MS: SCIEX QTRAP® 6500+ s IonDrive™ Turbo V, ± polarity switching (5 ms), Curtain Gas 30, IonSpray 5500 V/–4500 V, teplota 500/300 °C.
• Data processing: MultiQuant™ 3.0.2, Gaussian smooth 1.0 pt, minimum S/N 10, manuální validace.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace re‐re‐suspendace v 100 % fázi B přinesla zlepšení S/N až 60× oproti 75–85 % B. Metoda detekovala 263 unikátních metabolitů ze 312 cílů (296/363 Q1/Q3 přechodů). V porovnání s analytickým HILIC LC-MRM bylo dosaženo o 50 % více metabolitů v MDCK buňkách, 35 % více v moči a 11 % více v plazmě. Zlepšení průměrného S/N o 10× podpořilo detekci stopových úrovní a eliminaci nutnosti opakovaných injekcí či manuální validace.

Přínosy a praktické využití metody

• Jeden cílený LC-MS/MS běh pokrývá >300 polárních metabolitů napříč hlavními biochemickými drahami.
• Zvýšená citlivost a spolehlivost detekce minimálně 5–20× vyšší S/N.
• Snížená spotřeba rozpouštědel a provozní náklady díky microflow režimu.
• Vhodné pro screening biomarkerů, QA/QC v průmyslových a klinických laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace automatizované přípravy vzorků a on-line monitoringu.
• Rozšíření panelu cílených metabolitů a modulární rozvoj multidimenzionálních přístupů.
• Standardizace postupů pro klinickou metabolomiku a personalizovanou medicínu.
• Využití ve vývoji farmakokinetických modelů a toxikologických studiích.

Závěr

Navržené mikroflow HILIC LC-MRM s využitím SCIEX M3 MicroLC a QTRAP 6500+ dosahuje výrazného zlepšení citlivosti, pokrytí a efektivity analýzy polárních metabolitů v komplexních biologických vzorcích. Metoda nabízí škálovatelnou, rychlou a ekonomickou alternativu k tradičním přístupům, usnadňující výzkum metabolomických biomarkerů a aplikace v průmyslu i medicíně.

Reference

• Contrepois K., Jiang L., Snyder M. Optimized Analytical Procedures for the Untargeted Metabolomic Profiling of Human Urine and Plasma by Combining HILIC and RPLC–MS. Mol Cell Proteomics. 2015;14(6):1684–1695.
• Ivanisevic J., Zhu Z.J., Plate L. et al. Toward ‘Omic Scale Metabolite Profiling: A Dual Separation–Mass Spectrometry Approach for Coverage of Lipid and Central Carbon Metabolism. Anal Chem. 2013;85(14):6876–6884.
• Yuan M., Breitkopf S.B., Yang X., Asara J.M. A Positive/Negative Ion–Switching, Targeted Mass Spectrometry–Based Metabolomics Platform for Bodily Fluids, Cells, and Fresh and Fixed Tissue. Nat Protoc. 2012;7(5):872–881.
• Motamamedchaboki K., Ubhi B.K. Improved Detection of Polar Metabolites in Complex Matrices Using M3 MicroLC and QTRAP 6500+. SCIEX Technical Note RUO-MKT-02-6110-A. 2017.