Streamlining Discovery Microsomal Clearance and Metabolite ID Analysis using a TripleTOF® 6600 System

Význam tématu

V rané fázi vývoje léčiv je klíčové rychle a spolehlivě stanovit mikrosomální clearance a identifikovat metabolity vznikající při metabolizmu.
Kombinace kvantitativní a kvalitativní analýzy bez nutnosti opakovaných měření zvyšuje produktivitu a snižuje náklady.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo demonstrovat použití techniky SWATH® Acquisition 2.0 na systému TripleTOF® 6600 k souběžnému získávání přesných kvantitativních dat pro clearance i nepřednastavených kvalitativních dat pro identifikaci metabolitů.
Studie zahrnovala testování dvou modelových sloučenin, verapamilu a diklofenaku, při koncentracích 1 a 10 µM s různými časovými body inkubace s lidskými jaterními mikrosomy.

Použitá instrumentace

• Hmotnostní spektrometr TripleTOF® 6600 se softwarem Analyst TF 1.7
• UHPLC Shimadzu Nexera s kolonnou XBridge C18 (2.1×50 mm, 3,5 µm)
• Software MultiQuant 3.0 pro kvantitativní analýzu
• Software MetabolitePilot 2.0 Alpha pro identifikaci metabolitů

Použitá metodika

Analýza probíhala ve dvou režimech:

• Rychlý "high-throughput" gradient (2 min) pro screening stability a soft-spot posuzování
• Pomalejší gradient (17,5 min) pro detailní charakterizaci metabolitů

Data se sbírala jak informačně závislou akvizicí (IDA), tak data nezávislým režimem SWATH se 8 okny m/z 100–850.
Kvantifikace se prováděla pomocí TOF signálu a high resolution product ion (MRMHR) fragmentů.

Hlavní výsledky a diskuse

• SWATH akvizice poskytla data pro absolutní i relativní kvantifikaci ve třech řádech koncentrace (0,005–5 µM) a zároveň zachytila nízkohloubkové metabolity.
• Verapamil dosáhl CLint ≈ 83 mL/min/kg, diklofenac CLint ≈ 229 mL/min/kg, hodnoty odpovídají literatuře i historickým datům.
• U verapamilu SWATH umožnil zvolit slabší fragment po zjištění saturace detektoru, aniž by bylo nutné znovu analyzovat vzorek.
• Diklofenac vykazoval nízkou intenzitu mateřského iontu kvůli koliznímu ochlazení, přesto bylo možné přesné stanovení pomocí MRMHR fragmentů.
• SWATH generoval kompletní archiv spekter, což umožnilo retrospektivní vyhledávání a rychlou identifikaci soft-spotů metabolismu s MetabolitePilot.

Přínosy a praktické využití metody

• Eliminace potřeby samostatných metod pro kvantifikaci a kvalitativní identifikaci šetří čas a materiál.
• Kompletní spektrální archiv usnadňuje pozdější analýzy a retrospektivní vyšetřování.
• Metoda podporuje vysokou propustnost vzorků při zachování citlivosti a přesnosti.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možnost rozšíření SWATH aplikací i na další třídy malých molekul a biologických matric.
Integrace strojového učení pro automatizované zpracování a interpretaci komplexních datových souborů.
Rozvoj databází metabolitů a spektrálních knihoven pro rychlejší identifikaci neznámých látek.

Závěr

SWATH Acquisition 2.0 na systému TripleTOF® 6600 efektivně kombinuje vysokou kvantitativní citlivost s komplexními kvalitativními daty pro metabolitickou studii. Tento přístup zvyšuje efektivitu raného screeningu léčiv a umožňuje spolehlivou identifikaci metabolických soft-spotů bez kompromisů v kvalitě dat.

Reference

• Obach RS. Prediction of Human Clearance of Twenty-Nine Drugs from Hepatic Microsomal Intrinsic Clearance Data: An Examination of In Vitro Half-Life Approach and Nonspecific Binding to Microsomes. Drug Metab Dispos. 1999;27(11):1350–9.