Isotopically Resolved Subunit Analysis for Tracking Protein Therapeutic Stress Studies

Význam tématu

Analýza podjednotek bílkovin s isotopovým rozlišením představuje klíčový přístup při hodnocení komplexních bioterapeutik. Umožňuje detailní sledování post-translačních modifikací, jako je oxidace, při minimální přípravě vzorku a vysoké propustnosti. Tento postup napomáhá rychlejšímu charakterizování stability a kvality léčebných protilátek během vývoje a výroby.

Cíle a přehled studie / článku

Studie se zaměřuje na vývoj a aplikaci metody analýzy podjednotek NISTmAb podrobených časové křivce oxidačního stresu. Cílem bylo sledovat nárůst oxidovaných forem jednotlivých fragmentů protilátky (lehký řetězec, Fd, Fc/2) v průběhu 24 hodin a demonstrovat schopnost systému SCIEX X500B QTOF s vysokým rozlišením hmotnosti poskytovat přesná izotopová data.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky NISTmAb byly oxidovány 0,03% H2O2 po různých intervalech (0,5–24 h), reakce byla zastavena metioninem a proveden buffer exchange. Fragmentace protilátky proběhla enzymem IdeS následovanou redukcí TCEP. Separation zajišťovala kapalinová chromatografie ExionLC na kolonce Agilent PLRP-S při 80 °C. Hmotnostní spektrometrie využila SCIEX X500B QTOF se zdrojem Turbo V:

• Režim měření: pozitívní iontová móda
• GC1/GC2: 50, Curtain Gas 35
• Teplota: 400 °C, Ion spray 5000 V
• DP: 150 V, CE: 10 V
• Hmotnostní rozsah: 400–3000 Da, rozlišení izotopů 30 000

Hlavní výsledky a diskuse

Reprodukce chromatografie byla potvrzena překrytím total ion chromatogramů pro všechny časové body. Reakonstrukce nulových nábojových spekter ukázala jasné izotopové multiplety pro každou podjednotku. Oxidace se projevila posuny hmotnosti o +16 a +32 Da, přičemž Fc/2 fragment vykazoval nejvyšší náchylnost k oxidační degradaci. V raných fázích byl detekován i sodný adukt, který postupně ustoupil rostoucí koncentraci oxidovaných forem.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlé a citlivé sledování modifikací mAb podjednotek
• Minimalizace přípravné práce díky omezené proteolýze IdeS
• Vysoká přesnost hmotnostního určení umožňuje kvantifikaci oxidovaných forem
• Metoda je vhodná pro screening stability a kvality bioterapeutik

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření techniky na další typy post-translačních modifikací (glykování, deamidace) a automatizace přípravy vzorků. Další směry zahrnují integraci s pokročilou datovou analýzou a strojovým učením pro predikci stability a vývoj nových léčiv.

Závěr

Studie prokázala, že analýza podjednotek s isotopovým rozlišením na SCIEX X500B QTOF nabízí spolehlivý a přesný nástroj pro sledování oxidačního stresu protilátek. Metoda umožňuje detailní charakterizaci stability a je snadno adaptovatelná pro rutinní kontrolu kvality bioterapeutik.

Reference

Fan Zhang, Zoe Zhang, Ji Jiang, Sean McCarthy. Isotopically Resolved Subunit Analysis for Tracking Protein Therapeutic Stress Studies. SCIEX Framingham MA & Redwood City CA, 2018.