Taking Advantage of the Orthogonal Selectivities of Agilent InfinityLab Poroshell 120 C18 Columns for Method Development at Low pH

Význam tématu

Chromatografie malých molekul se široce využívá ve farmaceutickém výzkumu i kvalitativní kontrole. Kritickým aspektem je dosažení dostatečného rozlišení analizovaných látek, které umožní přesnou kvantifikaci i při použití méně selektivních detektorů nebo při potlačení rušení ionizací v LC-MS. Orthogonální selektivity sloupců s porézní vrstvou částic Poroshell 120 C18 nabízí výrazné zlepšení při vývoji metod s nízkým pH mobilní fáze.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat rozdílnou selektivitu čtyř fází Agilent InfinityLab Poroshell 120 C18 při analýze směsi veterinárních léků. Použit byl jednoduchý gradient založený na formiové kyselině a acetonitrilu. Porovnáním retenčních časů se ukázalo, že i mezi C18 fázemi existují významné rozdíly ovlivňující pořadí eluovaných látek a celkové rozlišení.

Použitá metodika a instrumentace

Pro experiment bylo použito:

• Agilent 1290 Infinity II LC systém modifikovaný pro nízkou disperzi objemu
• Agilent Ultivo LC/TQ hmotnostní spektrometr s Jet Stream ESI zdrojem
• Agilent 1290 Infinity II Diode Array detektor s ultranízkou disperzí
• Čtyři sloupce Agilent InfinityLab Poroshell 120 C18 (CS C18, SB C18, EC C18, HPH C18) o rozměrech 2.1×100 mm a velikosti částic 2.7 µm
• Gradientní eluce při 0.4 mL/min se 0.01 mg/mL standardem devíti veterinárních látek

Hlavní výsledky a diskuse

Teoretický výpočet rozlišení ukázal, že při konstantním počtu destiček a retenčním faktoru k’ je změna selektivity (α) nejvýkonnějším faktorem zlepšení rozlišení. S rostoucím α z 1.1 na 2.1 se teoretické rozlišení zvýšilo šestinásobně, zatímco navýšení počtu destiček pětinásobně přineslo jen mírný nárůst. Screening čtyř fází C18 prokázal, že sloupec CS C18 poskytuje nejodlišnější retenční vzorce pro testované analyty, což usnadňuje separaci bazických sloučenin při nízkém pH.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlý výběr nejvhodnějšího sloupce díky orthogonálním selektivitám bez nutnosti složité úpravy mobilní fáze. Zvolený jednoduchý gradient formiové kyseliny a acetonitrilu je ideálním výchozím bodem pro další doladění metod vývoje, zejména v QA/QC a farmaceutické analýze.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj se nabízí v oblasti modulace pH a volby organického rozpouštědla (acetonitril vs methanol) ke zvýšení selektivity. Vývoj nových modifikovaných stacionárních fází a automatizované screeningové platformy mohou dále zrychlit vývoj metod. Integrace výpočetních nástrojů pro optimalizaci parametrů chromatografie podpoří cílené navržení analytických podmínek.

Závěr

Ukázalo se, že orthogonální selektivity čtyř fází Poroshell 120 C18 pod nízkopH gradientem poskytují různorodé retenční vzorce, přičemž CS C18 dosáhlo nejlepší separace testované směsi veterinárních léků. Zvýraznění významu selektivity při rozvoji LC metod dovoluje efektivnější přístup k optimalizaci rozlišení a zkrácení doby vývoje analýzy.

Reference

• Gratzfield-Hugsen A; Naegele E; Maximizing Efficiency Using Agilent InfinityLab Poroshell 120 Columns; Agilent Technologies application note 5990-5602EN 2016
• Meyer V R; Practical High Performance Liquid Chromatography Fourth Edition Wiley 2004 str 34
• Mack A; Using pH as a Method Development Tool with Agilent InfinityLab Poroshell 120 CS C18; Agilent Technologies application note 5994-2274EN 2020