Catch Them Sleeping: Quick and Routine Quantification of Melatonin in Plasma with Ultivo LC/TQ

Význam tématu

Melatonin je endogenní hormon a neurotransmiter, který hraje klíčovou roli v regulaci cirkadiánního rytmu a spánku. Jeho stanovení v plasmě je zásadní pro výzkum farmakokinetiky, endogenní produkce a léčbu poruch spánku. Pro kvantitativní analýzy na úrovni nízkých ppt (picogramů na mililitr) je nezbytně nutná citlivá a specifická metodika, kterou nabízí LC/MS/MS technologie.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo vyvinout rychlou, rutinní a robustní metodu pro kvantifikaci melatoninu v humánní plasmě s použitím Agilent Ultivo LC/TQ. Studie demonstruje přenositelnost optimalizovaných MRM metod mezi rozdílnými triplekvadrupólovými platformami Agilent a ověřuje analytické parametry metody, zahrnující detekční limity, přesnost, linearitu a obnovu extrakce.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorku byla zvolena jednoduchá precipitace proteinů acetonitrilem. Pro interní standard sloužil izotopově značený MEL-D4, přidaný před extrakcí a po ní k výpočtu recovery. Na analýzu byl použit systém Agilent 1260 Infinity II Prime LC s kolonkou Poroshell 120 EC-C18 (2.1×50 mm, 1.9 µm) při 35 °C. Mobilní fáze A obsahovala 5 mM amonium formiátu, 0.2 mM amonium fluoridu a 0.1 % kyseliny formiové ve vodě; fáze B stejnou aditivaci v methanolu. Průtok činil 400 µL/min s gradientem od 5 % do 98 % fáze B za 3,1 minuty. Detekce probíhala na Agilent Ultivo Triple Quadrupole LC/MS s ESI v pozitivním módu. Optimální fragmentorové napětí a kolizní energie byly určeny softwarem MassHunter Optimizer.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizované MRM přechody m/z 233 → 174 a 233 → 159 vykázaly téměř identické parametry na přístrojích Ultivo a 6470 LC/TQ. Detekční limit (LOD) odpovídal nízkým jednotkám pg/mL, dolní kvantifikační limit (LLOQ) byl 10 pg/mL a horní kvantifikační limit (ULOQ) 100 ng/mL (rozsah čtyř dekád). Lineární korelace kalibrační křivky MEL-D4 dosáhla R² = 0,998 s vážením 1/x². Opakovatelnost retenčního času měla RSD 0,07 %. Obnova extrakce MEL-D4 činila průměrně 95 % (±6 %). Endogenní melatonin v plasmě byl kvantifikován korekcí volného signálu podle interního standardu.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje spolehlivou a citlivou rutinní analýzu melatoninu ve výzkumných i klinických laboratořích. Jednoduchá a rychlá příprava vzorku snižuje pracovní zátěž a náklady. Vysoká specificita MRM zajišťuje přesné stanovení nízkých koncentrací i v matricích s endogenním pozadím.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může směřovat k multiplexnímu stanovení dalších neurotransmiterů a hormonů v jednom běhu. Automatizace přípravy vzorků a integrace do online workflow zvýší laboratořní propustnost. Zkoumání alternativních ionizačních zdrojů a nanoLC přinese další zlepšení citlivosti.

Závěr

Vyvinutá metoda pomocí Ultivo LC/TQ s ESI nabízí vysokou citlivost, přesnost a linearitu pro kvantifikaci melatoninu v plasmě. Minimalizuje přípravu vzorku a poskytuje ekonomické řešení pro farmakokinetické a bioanalytické studie.