A Rapid, Simple and Sensitive Assay for Quantitative Determination of Melatonin in Human Plasma Using Shimadzu LCMS-8045

Význam tématu

Melatonin je klíčový endogenní hormon regulující cirkadiánní rytmus a spánek a nachází široké využití v léčbě nespavosti, jet lagu či poruch cirkadiánního rytmu u osob se zrakovým postižením. Kvantitativní analýza melatoninu v plazmě s velmi nízkými detekčními limity je nezbytná pro studií farmakokinetiky nízkých dávek a pro splnění přísných regulačních požadavků.

Cíle a přehled studie

Vyvinout rychlou, jednoduchou a vysoce citlivou bioanalytickou metodu pro stanovení melatoninu v lidské plazmě s dolní hranicí kvantifikace (LLOQ) 5 pg/mL a minimálním objemem plazmy 200 µL. Metoda byla kompletntě validována podle směrnic FDA a umožňuje okamžitý přenos do rutinního laboratorního provozu.

Použitá metodika a instrumentace

Postup extrakce:

• 200 µL lidské plazmy přidané 50 µL interního standardu (melatonin-D4, 5 ng/mL).
• Liquid-liquid extrakce 2,5 mL ethyl acetátu, vortex 5 min, centrifugace 15 min při 5 °C.
• Evaporace supernatantu pod dusíkem, rekonstituce 300 µL roztoku pro injekci.

Chromatografie a MS:

• U-HPLC isokratický režim: 50:50 methanol–0,1 % formic acid, Shim-pack GIST C18 (75×3 mm, 2 µm), průtok 0,4 mL/min, teplota 50 °C, injekce 20 µL.
• LCMS-8045 s ESI v pozitivním módu, MRM přechody 232.95→173.90 pro melatonin a 237.10→178.20 pro IS.
• UF-Qarray™ ion guide a vyhřívaná ESI zvyšují ionizaci a přenos signálu.

Použitá instrumentace

• Shimadzu LCMS-8045
• Nexera X2 UHPLC
• Shim-pack GIST C18 kolona
• UF-Qarray™ ion guide

Hlavní výsledky a diskuse

• LLOQ 5 pg/mL s poměrem signál/šum > 20:1.
• Lineární rozsah 5–10 000 pg/mL, korelační koeficient r > 0,99.
• Intradenní přesnost (%RSD) ≤ 8,8 % (LLOQ), ≤ 3,2 % (LQC–HQC); accuracy 96–117 %.
• Mezidenní přesnost (%RSD) ≤ 18 % (LLOQ), ≤ 3,4 % (LQC–HQC); accuracy 97–104 %.
• Recovery ~79 % s %RSD 0,07; matrix factor LQC 1,12, HQC 1,05.
• Výborná selektivita v šesti plazmatických loty, žádné carry-over.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda vyžaduje nízký objem plazmy, minimalizuje životnost kolony i hmotového spektrometru a zvyšuje propustnost vzorků díky krátkému analytickému běhu 3,5 minuty. Je snadno přenositelná do rutinních farmakokinetických a klinických laboratoří.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření na vícenásobné stanovení dalších hormonů či metabolitů v jednom běhu, automatizace extrakce, miniaturizace odběru biologického materiálu a využití pokročilých analytických nástrojů, včetně AI-řízené optimalizace metod.

Závěr

Vyvinutá a validovaná LC-MS/MS metoda na přístroji Shimadzu LCMS-8045 dosahuje vynikajících analytických parametrů pro kvantifikaci melatoninu v lidské plazmě, splňuje regulatorní požadavky a je okamžitě aplikovatelná v klinických a farmakokinetických studiích.

Reference

1. https://go.drugbank.com/drugs/DB01065
2. Gooneratne NS, Edwards AY, Zhou C, Cuellar N, Grandner MA, Barrett JS. Melatonin pharmacokinetics following two different oral surge-sustained release doses in older adults. J Pineal Res. 2012;52(4):437-445.
3. Zhao H, Wang Y, Jin Y, Liu S, Xu H, Lu X. Rapid and sensitive analysis of melatonin by LC-MS/MS and its application to pharmacokinetic study in dogs. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 2016;11(2):273-280.