Rapid and Sensitive Quantitation of Metanephrines and 3-Methoxytyramine in Human Plasma Using an Agilent Ultivo Triple Quadrupole LC/MS

Význam tématu

Stanovení metanefrinů (MN, NMN) a 3-metoxytyraminu (3-MT) v lidské plasmě má klíčový význam pro diagnostiku a monitorování neuroendokrinních onemocnění, jako je feochromocytom či paragangliom. Citlivá a specifická analýza těchto O-metylovaných metabolitů katecholaminů je nezbytná pro klinickou laboratoř i pro výzkumné projekty v oblasti metabolomiky.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vyvinout rychlý, citlivý a reprodukovatelný LC/MS/MS postup na Agilent Ultivo Triple Quadrupole systému. Analyty byly chromatograficky rozděleny pod čtyřmi minutami, dosažené limity detekce (LOD) činily 4 ng/L pro MN a 3-MT a 20 ng/L pro NMN. Metodu validovali pomocí certifikovaných referenčních vzorků ChromSystems.

Použitá instrumentace

Pro separaci a detekci byly použity tyto komponenty:

• Agilent 1260 Infinity II LC systém s binary pumpou, multisamplerem a multicolumn compartment
  
• Agilent Ultivo Triple Quadrupole (G6465B) s AJS elektrospray zdrojem
  
• SPE zařízení: SampliQ WCX SPE cartrdiges 30 mg, pozitivně tlakový manifold PPM-48
  
• UHPLC kolona Agilent Pursuit PFP 3,0 × 100 mm, 3 μm s Poroshell 120 PFP guard kolonkou
  
• Ultrapure voda Millipore a LC/MS grade organické rozpouštědla
  

Použitá metodika

Vzorek 500 μL plazmy se smíchal s 10 mM pufrem NH4H2PO4 a podrobil se SPE WCX čištění na PPM-48. Eluce byla provedena 500 μL methanolu s 2 % kyseliny mravenčí. Suchý extrakt se rekonstituoval v 100 μL 5/95 methanol/voda (0,1 % formové kyseliny) a injektovalo se 20 μL.

Chromatografie:

• Gradient 5–95 % methanolu + 0,1 % formové kyseliny v 4 minutách při 0,55–0,80 mL/min
• Teplota kolony 30 °C, autosampler na 6 °C

MS/MS nastavení:

• MRM přechody optimalizované v MassHunter optimizeru
• Pozitivní ionizace, suchý plyn 11 L/min při 325 °C, sheath plyn 12 L/min při 375 °C
• Navedení signálu diverterem do odpadu po 4,4 min pro eliminaci rušení

Hlavní výsledky a diskuse

Citlivost: LOD 4 ng/L pro MN a 3-MT, 20 ng/L pro NMN. LOQ odpovídala 10 ng/L (MN, 3-MT) a 40 ng/L (NMN).

Lineární rozsah: Kalibrační křivky (1/x váha) byly vysoce lineární (R2 > 0,999) pro všechny tři cíle.

Přesnost a opakovatelnost: Retenční časy %RSD < 0,3 %, odezvy interních standardů %RSD < 6 %. Intraday přesnost (90–110 %) a preciznost (CV < 4 %) napříč kalibrační řadou.

Recovery: Celkové výtěžky 90–110 % při LQC, MQC a HQC s intraday RSD ≤ 5 % a interday RSD ≤ 4 %.

Carryover: < 0,02 % vůči nejvyšší kalibraci a < 2 % vůči nejnižší kalibraci.

Rozlišení: Agilent Pursuit PFP kolona dosáhla baseline separace MN, NMN a 3-MT pod čtyřmi minutami. Metodu úspěšně rozšířili na simultánní měření epinefrinu, norepinefrinu a dopaminu.

Přínosy a praktické využití metody

Rychlý 10minutový workflow nabízí klinickým laboratořím i výzkumným pracovištím efektivní alternativu k HPLC-ECD/FLD a k močovým testům. Vysoká citlivost a reprodukovatelnost podporují přesné stanovení malých koncentrací v plazmě, což zvyšuje diagnostickou jistotu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možnosti dalšího rozvoje:

• Automatizace SPE pro vyšší sériovou kapacitu
• Rozšíření na další katecholaminy a metabolity v komplexních biologických matricích
• Integrace do cílených metabolomických studií a klinických plošin
• Vyšší úroveň multiplexních kvantitativních panelů pro endokrinní a neurochemické biomarkery

Závěr

Vyvinutý LC/MS/MS postup kombinuje efektivní SPE čištění, rychlou UHPLC separaci a specifickou detekci MRM na Agilent Ultivo TQ. Metoda splňuje přísné požadavky na citlivost, linearitu a reprodukovatelnost a nabízí významnou výhodu v klinickém i výzkumném prostředí.

Reference

1. Lee SY, Cazenave-Gassiot A, Pakkiri LS, Drum CL, Wenk MR, Bendt AK et al. Rapid and Sensitive Quantitation of Metanephrines and 3-Methoxytyramine in Human Plasma Using an Agilent Ultivo Triple Quadrupole LC/MS. Agilent Technologies Application Note 5994-4729EN, 2022.