Determination of Testosterone in Human Serum using Ultivo Triple Quad LC/MS

Význam tématu

Volné testosteron je klíčovým biomarkerem hormonálních stavů u mužů i žen. Jeho přesné stanovení v lidském séru umožňuje diagnostiku poruch reprodukčního systému, sledování léčebných terapií a kontrolu kvality ve farmaceutickém výzkumu. Rychlá a citlivá LC-MS/MS analýza přispívá ke spolehlivosti výsledků a zvyšuje efektivitu laboratorních procesů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout robustní a citlivou metodu pro kvantifikaci volného testosteronu v lidském séru pomocí kompaktního hmotnostního spektrometru Ultivo s trojčlenným kvadrupólem. Studie hodnotila limity kvantifikace, přesnost, linearitu kalibrační křivky a reprodukovatelnost měření.

Použitá instrumentace

• HPLC: Agilent 1290 Infinity UHPLC s binárním čerpadlem, autosamplerem (4 °C) a termostatovanou kolonou (55 °C).
• Kolona: Poroshell 120 EC-C18 (2.1×50 mm, 2.7 µm).
• MS: Agilent Ultivo triple quadrupole s technologií VacShield, Cyclone Ion Guide a dodekapólovou kolizní buňkou.
• Software: MassHunter Quantitative Analysis s přizpůsobeným rozhraním Quant-My-Way (Vanilla flavor).

Použitá metodika

Metoda zahrnovala následující kroky:

1. Příprava vzorků: srážecí extrakce lidského séra acetonitrilem, centrifugace, ředění supernatantu vodou.
2. Interní standard: d3-testosteron přidán do matrice a kalibrátorů pro stabilní kvantifikaci (25 ng/mL).
3. Chromatografie: gradientní eluce mobilní fází (0.1 % kyselina mravenčí s 5 mM acetátem amonným a methanolem), průtok 0.5 mL/min.
4. MRM akvizice: přechody pro testosteron (m/z 289.2→109.1, 289.2→97.0) a d3 (292.2→97.0), dwell 75 ms, fragmentor 130 V, CE 17–18 V.
5. Kalibrace: jedenáctibodový rozsah 0.001–100 ng/mL, lineární vážení 1/x, koeficient R² > 0.999.

Hlavní výsledky a diskuse

• Citlivost: detekce od 1 pg/mL (20 fg on-column) se signál-šum výrazně nad pozadím.
• Linearita: vynikající kalibrační křivka (R² > 0.999) v rozsahu 1 pg/mL až 100 ng/mL.
• Přesnost a reprodukovatelnost: intraday a interday %RSD < 5 % na všech úrovních.
• Rychlost analýzy: doba cyklu 6 minut včetně chromatografie a detekce.

Přínosy a praktické využití metody

• Snížené nároky na údržbu a intuitivní obsluha pro uživatele bez pokročilých MS zkušeností.
• Vysoká laboratorní produktivita díky zkrácenému času od akvizice k výsledkům.
• Vhodné pro klinické laboratoře, farmaceutický výzkum a QA/QC procesy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze dále validovat v různých krevních matricích a s alternativními technikami přípravy vzorků (SPE, proteinová precipitace). Další rozvoj může zahrnovat multiplexní stanovení steroidů a plnou automatizaci pracovních postupů.

Závěr

Studie potvrdila, že kompaktní Ultivo triple quad nabízí srovnatelnou analytickou výkonnost s většími systémy. Metoda dosahuje vysoké citlivosti, lineárnosti a reproducibility pro stanovení volného testosteronu v lidském séru v rámci 6 minut analýzy.

Reference

• Analysis of testosterone and dihydrotestosterone in mouse tissues by liquid chromatography-electro-spray tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry, 2010, 402(2), 121–128.