Improved profiling of sialylated N-linked glycans by ion chromatography-Orbitrap mass spectrometry

Význam tématu

Profilování sialylovaných N-vázaných glykosidů má klíčový význam pro charakterizaci struktury glykoproteinů, které ovlivňují biologické funkce i vlastnosti terapeutických proteinů. Precizní oddělení a identifikace glykanů je nezbytná pro zajištění kvality a konzistence biotechnologických produktů, sledování glykoformálních změn během výrobních procesů a hlubší pochopení jejich biologické aktivity.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této práce je představit vylepšenou metodu pro profilování sialylovaných N-vázaných glykanů kombinací vysokovýkonné aniontové výměnné chromatografie (HPAE) s Orbitrap hmotnostní spektrometrií. Studie využívá modelové vzorky ze čtyř glykoproteinů (bovine fetuin, bovine thyroglobulin, bovine fibrinogen a lidský α1-kyselý glykoprotein), aby demonstrovala vliv změn hydroxidické koncentrace a teploty na chromatografickou rozlišitelnost a následnou strukturní identifikaci glykanů.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:
Glykanové oligosacharidy uvolněné enzymem PNGase F byly separovány na kolonosystému Dionex CarboPac PA200 pomocí gradientu NaOH/NaOAc. Po chromatografii byl eluát odváděn skrze elektrolyticky regenerovaný desalter ERD 500 pro odstranění sodných iontů a následně analyzován v negativním módu na Orbitrap Q Exactive s HCD fragmentací. Data byly zpracována v Chromeleon a Xcalibur a glykanové struktury potvrzeny pomocí softwaru SimGlycan.

Instrumentace:

• Dionex ICS-5000+ HPIC systém (SP/DP pumpa, DC detektor, elektrochemická buňka s Au elektrodou)
• Kolona CarboPac PA200 analytická (3×250 mm) a guard (3×50 mm)
• Dionex ERD 500 destripping/modul pro odstranění sodíku
• Thermo Scientific Q Exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap MS s HESI-II ionizačním zdrojem
• Thermo Scientific Dionex AS-AP autosampler s chladící vložkou
• Centrifuga Eppendorf 5400, Nalgene 0.2 µm nylonové filtry a autosamplerové vialy
• Software Chromeleon 7.2.9, Xcalibur 4.1, TraceFinder a SimGlycan v. 5.0

Hlavní výsledky a diskuse

• Zvýšení koncentrace NaOH z 100 mM na 150 mM při 25–35 °C vedlo k výraznému zlepšení celkového chromatografického rozlišení, zejména izomerů glykanů.
• Nižší teplota kolony (25 °C) byla obecně příznivější pro ostřejší vrcholy a lepší separaci sialylovaných forem.
• Fucosylované glykany byly spolehlivě odděleny od nefucosylovaných analogů při nižší koncentraci hydroxidu, což usnadňuje identifikaci fukozylace.
• U některých di- a monosialylovaných glykanů došlo ke změně eluačního pořadí při vyšší koncentraci NaOH – disialoformy se mohou vázat silněji než monoformy.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a bezderivátová separace i detekce sialylovaných i nesialylovaných glykanů zvyšuje efektivitu glykotypizace.
• Metoda umožňuje systematické sledování glykoformálních změn v bioprodukčním procesu a validaci výrobních šarží.
• Vysoká rozlišovací schopnost podporuje vývoj glykanových databází a rychlou identifikaci struktur.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace HPAE-PAD/MS do plně automatizovaných linek pro vysokoobjemové laboratorní nasazení.
• Využití pokročilých algoritmů strojového učení pro predikci glykanových struktur z hmotnostních spekter.
• Rozšíření metody o další ionizační módy a fragmentační techniky pro hloubkovou elucidaci vazeb a pozic substituentů.

Závěr

Představená kombinace optimalizované HPAE-PAD separace a vysoce přesné Orbitrap hmotnostní spektrometrie nabízí významné zlepšení rozlišení sialylovaných i izomerických glykanů. Metoda přináší robustní nástroj pro kvalitativní i kvantitativní glykoanalýzu v akademickém i průmyslovém prostředí.

Reference

1. Spiro RG. Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease implications of glycopeptide bonds. Glycobiology. 2002;12(4):43R–56R.
2. Shental-Bechor D, Levy Y. Effect of glycosylation on protein folding: a close look at thermodynamic stabilization. PNAS. 2008;105(24):8256–8261.
3. Brandley BK, Schnaar RL. Cell-surface carbohydrates in cell recognition and response. J Leukoc Biol. 1986;40(1):97–111.
4. Thermo Scientific Application Update AU72829. HPAE-PAD analysis of N-linked glycans: improving glycan resolution.
5. Hermentin P, Witzel R, Vliegenthart J, Kamerling J, Nimtz M, Conradt H. A strategy for the mapping of N-glycans by high-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection. Anal Biochem. 1992;203(2):281–289.
6. Grey C, Edebrink P, Krook M, Jacobsson S. Development of a high performance anion exchange chromatography analysis for mapping of oligosaccharides. J Chromatogr B. 2009;877:1827–1832.
7. Thermo Scientific Technical Note TN71: Eluent Preparation for High-Performance Anion-Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection.
8. Thermo Fisher Scientific Technical Note TN72478: Instrument configuration for native N-linked oligosaccharide characterization by HPAE-PAD/MS.
9. Cooper G, Rohrer J. Separation of neutral asparagine-linked oligosaccharides by high-pH anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection: empirical relationships between oligosaccharide structure and chromatographic retention. Glycobiology. 1995;5(4):359–360.
10. Thermo Scientific Application Note AN595: Integrated LC/MS Workflow for the Analysis of Labeled and Native N-Glycans from Proteins Using a Novel Mixed-Mode Column and a Q Exactive Mass Spectrometer.
11. Rohrer J. Separation of asparagine-linked oligosaccharides by high-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection: empirical relationships between oligosaccharide structure and chromatographic retention. Glycobiology. 1995;5(4):359–360.
12. Basa L, Spellman M. Analysis of glycoprotein-derived oligosaccharides by high-pH anion-exchange chromatography. J Chromatogr A. 1990;499:205–220.